王宏華，劉菲，孫浩思

（北京燕京啤酒集團(tuán)公司技術(shù)中心，啤酒釀造技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京101300）

柱前在線衍生-高效液相色譜法測(cè)定保健食品納豆膠囊中的?；撬?/p>

王宏華，劉菲，孫浩思

（北京燕京啤酒集團(tuán)公司技術(shù)中心，啤酒釀造技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京101300）

建立了檢測(cè)保健食品中牛磺酸的柱前在線衍生-高效液相色譜方法。樣品經(jīng)過(guò)去離子水提取，與鄰苯二甲醛在線衍生，以A相：0.02 mmol/L的乙酸鈉（pH 7.2，0.018%三乙胺，0.3%的四氫呋喃）；B相：100 mmol/L的乙酸鈉（pH 7.2）20%，乙腈40%，甲醇40%為流動(dòng)相，梯度洗脫，采用Thermo Hypersil ODS C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）分離，紫外線檢測(cè)。方法檢出限為0.51 mg/L；標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0～1 000.0 mg/L，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，具有良好的線性關(guān)系，加標(biāo)回收率為103.9%～105.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～2.9%。該方法的靈敏度高、準(zhǔn)確性好、前處理操作簡(jiǎn)單，適用于保健食品納豆膠囊中?；撬岷康臋z測(cè)。

鄰苯二甲醛；柱前在線衍生；高效液相色譜；?；撬?；保健食品；納豆膠囊

?；撬嵊址Q2-氨基乙磺酸，因1827年首次從牛膽汁分離出來(lái)而得名，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)其的認(rèn)知只停留在無(wú)功能的代謝產(chǎn)物。直到1975年HAYES K C等[1]發(fā)現(xiàn)因缺乏?；撬峥墒关埖囊暰W(wǎng)膜老化甚至失明，?；撬岬臓I(yíng)養(yǎng)生理功能才得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視并得以研究，此過(guò)程也逐步深入認(rèn)識(shí)了其生物營(yíng)養(yǎng)學(xué)價(jià)值。目前，美國(guó)、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家有99%的?；撬嵊糜谑称诽砑觿鼈円?guī)定在嬰幼兒食品中必須添加一定量的?；撬醄2]。我國(guó)在這方面起步較晚，在1993年批準(zhǔn)?；撬嵩谌橹破贰胗變菏称泛凸任镏破?、強(qiáng)化飲料中使用。諸多研究表明，?；撬峋哂袕V泛的生理功能，是調(diào)節(jié)機(jī)體正常生理活動(dòng)的重要活性物質(zhì)，在實(shí)際生產(chǎn)和日常生活中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[3]。

?；撬岱肿邮綖镃2H6N2O3S，分子質(zhì)量為125.15[4]。純品為無(wú)色或白色斜狀晶體，無(wú)臭，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，溶于乙醚等有機(jī)溶劑，是一種含硫的非蛋白氨基酸，在體內(nèi)以游離狀態(tài)存在，不參與體內(nèi)蛋白的生物合成[5]。?；撬犭m不參與體內(nèi)蛋白質(zhì)合成，但卻與胱氨酸、半胱氨酸的代謝密切相關(guān)[6]，具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、促進(jìn)脂肪乳化、改善視功能和抗氧化等生理功能。人體主要通過(guò)攝取食物中的?；撬釢M足機(jī)體需要。牛磺酸幾乎存在于所有生物之中，哺乳動(dòng)物的主要臟器（如心、腦、肝臟）中含量較高，海產(chǎn)品中含量頗為豐富[7]。

目前測(cè)定食品中?；撬岬姆椒ㄖ饕懈咝б合嗌V（high performance liquid chromatography，HPLC）熒光法[8]、薄層色譜法[9]、氣相色譜法[10-11]、高效液相色譜法[12-14]、氨基酸自動(dòng)分析法[7]、酸堿滴定法[4]等。酸堿滴定法簡(jiǎn)便易行，原理簡(jiǎn)單，但靈敏度及準(zhǔn)確度均較低，且測(cè)定過(guò)程中干擾較多，個(gè)樣的差別較大，無(wú)法滿足?；撬岷枯^低的樣品的測(cè)定。薄層色譜法靈敏度較低、屬于半定量的方法，而且薄層厚度、薄層板的制備、點(diǎn)樣技術(shù)以及展開的條件等難以保持恒定，從而影響定量的準(zhǔn)確性。氣相色譜法對(duì)樣品的衍生化等方面要求較高。氨基酸自動(dòng)分析法在分析的種類和數(shù)量等方面受到限制。由于高效液相色譜法較高的靈敏度、可靠性及相對(duì)較短的分析時(shí)間，使其成為測(cè)定?；撬嶙畛Ｊ褂玫姆椒╗15]。任一平等[12]應(yīng)用鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）柱前衍生法測(cè)定食品中的?；撬?，樣品經(jīng)預(yù)處理后，按比例加入定量的OPA衍生反應(yīng)試劑，在堿性條件下與樣液中的牛磺酸生成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)，在開始衍生反應(yīng)1 min后，立即終止反應(yīng)，進(jìn)樣測(cè)定。孫潔[13]研究比較了氨基酸分析（amino acid analyzer，AAA）法與HPLC法，AAA法主要是樣品經(jīng)前處理，用去蛋白之后的樣液經(jīng)離子交換柱層析分離，被分離出的氨基酸通過(guò)柱后衍生與茚三酮溶液反應(yīng)顯色，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。丹磺酰氯柱前衍生HPLC測(cè)定?；撬?，試樣經(jīng)水溶解提取，沉淀蛋白后取上清液用丹磺酰氯衍生化反應(yīng)，室溫避光衍生反應(yīng)2 h，加入鹽酸甲胺溶液終止反應(yīng)，上清液進(jìn)樣測(cè)定。這兩種方法的前處理過(guò)于復(fù)雜，不容易操作。本研究借鑒萬(wàn)玉萍等[14]的方法中的樣品前處理，對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行了優(yōu)化，樣品應(yīng)用OPA柱前在線衍生測(cè)定保健食品納豆膠囊中的?；撬幔椒ê?jiǎn)捷可靠，結(jié)果重復(fù)性良好。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕京中發(fā)牌改善記憶膠囊：北京燕京中發(fā)生物技術(shù)有限公司。

鄰苯二甲醛（10 mg/mL）、硼酸緩沖液（0.4 mol/L，pH 10.2）：美國(guó)安捷倫公司；冰醋酸（純度99.5%）、甲醇、乙腈（色譜級(jí)）、無(wú)水乙酸鈉（分析純）、三乙胺、四氫呋喃（色譜級(jí)）、?；撬幔兌取?9%）：美國(guó)Sigma公司；所有用水都采用Milli Q純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀（真空脫氣器、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、UV檢測(cè)器）：美國(guó)安捷倫公司；B1210E-DTH超聲水?。好绹?guó)賽默飛世爾公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：BDS HYPERSIL C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相：0.02 mmol/L乙酸鈉加0.018%三乙胺混勻，用10%冰乙酸調(diào)pH值至7.2，加0.3%的四氫呋喃混勻，過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾備用；B相：20%100 mmol/L乙酸鈉，用10%冰乙酸調(diào)pH值至7.2，體積分?jǐn)?shù)為40%乙腈、40%甲醇過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾備用；程序洗脫梯度如表1所示；流速：1 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：1 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：338 nm。

表1 樣品梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of samples

1.3.2 標(biāo)樣溶液配制

稱取?；撬針?biāo)樣100.0 mg于50 mL容量瓶中，用去離子水溶解定容，配制成質(zhì)量濃度為2 000.0 mg/L的貯備液，于4℃冷藏備用。工作標(biāo)準(zhǔn)溶液用去離子水把貯備液稀釋成100.0 mg/L。

1.3.3 樣品處理

稱取樣品（納豆膠囊內(nèi)部粉末）200.0 mg于100 mL容量瓶中，加入適量去離子水溶解樣品，放置于143 W超聲波水浴中室溫提取10 min，用去離子水定容，折疊濾紙過(guò)濾，濾液用0.45 μm濾膜過(guò)濾后備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相與波長(zhǎng)的選擇

分別比較了使用10 mmol/L的乙酸鈉緩沖液-乙腈= 70∶30及甲醇-乙腈-乙酸鈉梯度洗脫，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)后者的分離效果更好。另比較不同的檢測(cè)器波長(zhǎng)（330 nm和338 nm），發(fā)現(xiàn)前者雜峰的響應(yīng)要高于后者，因此選用338 nm為試驗(yàn)用波長(zhǎng)。

2.2 衍生試劑用量的試驗(yàn)

本研究的納豆膠囊[16]用于增強(qiáng)免疫力、改善記憶力，牛磺酸作為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到納豆膠囊中，一般添加量為10 g/100 g左右，而OPA衍生試劑的用量需通過(guò)試驗(yàn)確定。在任一平等[12]的研究中，20 μL樣品加20 μL OPA衍生試劑，萬(wàn)玉萍等[14]的研究中以2.5 μL樣品加2.5 μL OPA衍生試劑，樣品與衍生試劑都是1∶1關(guān)系?？紤]到原有檢測(cè)啤酒中氨基酸方法是以1.0μL樣品加1.0μLOPA衍生試劑，以防衍生不徹底，取三份1.0μL牛磺酸標(biāo)樣（1 000.0 mg/L），分別加入1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL OPA衍生試劑作樣品制備和分析，結(jié)果見表2。

表2 OPA衍生劑用量試驗(yàn)Table 2 OPA derivative dosage test

由表2可見，隨著衍生試劑用量的增加，測(cè)得的色譜峰面積逐漸變小，可能是由于總體積增加而使得色譜峰面積值減少，但換算成相同總體積時(shí)，面積依然減少，說(shuō)明衍生試劑用量在2.0 μL、4.0 μL時(shí)沒(méi)有更多的衍生化?；撬岙a(chǎn)生，可確定衍生試劑1.0 μL時(shí)衍生完全。

2.3 衍生時(shí)間的試驗(yàn)

在所有查找的資料中，衍生反應(yīng)時(shí)間各不相同，有反應(yīng)1 min[12]、2 min[13]后進(jìn)樣。就此展開試驗(yàn)，在其他條件不改變的情況下，進(jìn)樣器程序中選擇混合振蕩后直接進(jìn)樣，和混合振蕩后等待1 min、2 min進(jìn)樣，試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有區(qū)別。因此，選擇混合振蕩后直接進(jìn)樣。

2.4 方法線性關(guān)系及檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)貯備液適當(dāng)稀釋，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。以?；撬岬捻憫?yīng)峰面積（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X，mg/L）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of taurine

由圖1可知，其線性范圍為0～1 000.0 mg/L，線性方程為Y=2.189 2X+2.760 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，?；撬岬馁|(zhì)量濃度與其峰面積具有較好的線性關(guān)系，并以3倍信噪比，得出方法檢出限為0.51 mg/L。

2.5 方法精密度試驗(yàn)

取3種不同添加量膠囊樣品，按照方法要求，分別測(cè)定其牛磺酸含量，在重復(fù)條件下獲得的6次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果及均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果如表3所示。

表3 精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of precision experiment

由表3可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.9%～2.9%，＜5%，表明該方法有很好的精密度。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取一已知本底質(zhì)量濃度的納豆膠囊，分別添加50.0 mg/g、100.0 mg/g的牛磺酸，去離子水為提取劑，重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果見表4。?；撬針?biāo)樣、樣品及樣品加標(biāo)的譜圖見圖2。

表4 回收率測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 4 Determination results of recovery rate(n=3)

圖2 ?；撬針?biāo)樣、樣品及樣品加標(biāo)的圖譜Fig.2 Chromatogram of tanrine standard sample,sample and adding standard sample

由表4可知，平均加標(biāo)回收率為103.9%～105.0%，表明方法準(zhǔn)確度較好。

2.7 樣品的檢測(cè)與分析

分別對(duì)不同批次的成品膠囊進(jìn)行牛磺酸含量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表5所示。

表5 納豆膠囊中?；撬岷縏able 5 Taurine content in natto capsule

由表5可知，每粒膠囊0.4 g，含?；撬?5 mg左右，每天2次，每次3粒，可以作為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑[17]使用，給人體提供270 mg相當(dāng)含量的?；撬?。

3 結(jié)論

采用HPLC柱前在線衍生方法可以準(zhǔn)確測(cè)定保健食品納豆膠囊中的?；撬?，該法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～2.9%，回收率為103.9%～105.0%。另由于?；撬岫酁橛坞x態(tài)存在，易于與其他作用于蛋白質(zhì)合成的氨基酸相區(qū)別，因而本方法靈敏度高，專一性強(qiáng)，最低檢出限為0.51 mg/L?？勺鳛橘|(zhì)量監(jiān)督控制的有效方法，為其穩(wěn)定高效的生產(chǎn)提供技術(shù)保障。

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Determination of taurine in health food natto capsules by HPLC with precolumn derivatization

WANG Honghua,LIU Fei,SUN Haosi
(Beijing Key Laboratory of Beer Brewing Technology,Technical Center of Beijing Yanjing Beer Group Corporation, Beijing 101300,China)

The determination method of taurine in health food was established by HPLC with precolumn derivatization.Samples were extracted with deionized water,online derived with o-phthalaldehyde derivation,using phase A:0.02 mmol/L sodium acetate(pH 7.2,0.018% triethylamine,0.3% tetrahydrofuran);phase B:100 mmol/L sodium acetate(pH 7.2)20%,acetonitrile 40%,methanol 40%as mobile phase to conduct gradient elution. Samples were separated by Thermo Hypersil ODS C18column(4.6 mm×150 mm,5 μm)and detected by ultraviolet light.The detection limit was 0.51 mg/L,the standard curves were linear in the range of 0-1 000.0 mg/L,the linear relation was good with correlation coefficient R2=0.999 2;the adding recovery rate was 103.9%-105%,and the relative standard deviation was 0.9%-2.9%.The method has the advantage of high sensitivity,good accuracy,easy to operate,and suitable for determination of taurine content in health food natto capsules.

O-phthalaldehyde;online precolumn derivatization;HPLC;taurine;health food;natto capsules

O657.7

A

0254-5071（2014）10-0136-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.033

2014-08-15

北京市燕京啤酒集團(tuán)內(nèi)部課題

王宏華（1973-），女，高級(jí)工程師，本科，研究方向?yàn)橐合嗌V技術(shù)在啤酒釀造過(guò)程中的應(yīng)用。