，，，，，

（1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 動物檢疫研究所，北京100029；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010018）

貝類派琴蟲原位雜交檢測方法的建立與應(yīng)用

王彩霞1，馮春燕1，袁向芬1，鄧俊花1，王宗祥2，吳紹強1

（1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 動物檢疫研究所，北京100029；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010018）

本研究選擇派琴蟲特異性引物PerkITS85和PerkITS750的PCR擴增產(chǎn)物進行地高辛標(biāo)記制備探針，探索建立了派琴蟲的組織切片原位雜交檢測方法，并應(yīng)用該方法檢測我國黃海海域采集的貝類樣品。研究結(jié)果表明，PerkITS85和PerkITS750的PCR擴增產(chǎn)物大小為673bp，利用隨機引物擴增法制備的派琴蟲地高辛標(biāo)記探針特異性好，與包納米蟲和尼氏單孢子蟲均無交叉反應(yīng)。以世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的瑞氏液體羥基乙酸鹽（RFTM）培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)對本研究建立的原位雜交檢測方法進行評價，其診斷敏感性（Dse）為90.9%，診斷特異性（Dsp）為100%。實際檢測應(yīng)用表明本研究所建立的派琴蟲原位雜交檢測方法是一種有效的派琴蟲檢測方法，可以應(yīng)用于派琴蟲病的檢測。

貝類；派琴蟲；原位雜交；RFTM；檢測

貝類派琴蟲?。≒erkinsosis）是由派琴蟲引起的一種危害貝類養(yǎng)殖業(yè)的全球性疫病，病原包括奧爾森派琴蟲（Perkinsus olseni）和海水派琴蟲（P. marinus）等6個種[1]。目前瑞氏液體羥基乙酸鹽（RFTM）培養(yǎng)法是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的派琴蟲病金標(biāo)檢測方法[2]，敏感性高，但是特異性較差，與腰鞭毛蟲有交叉反應(yīng)，而且檢測時間較長（需4～7天）[3-5]。

原位雜交技術(shù)（in-situ hybridization，ISH）是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一種檢測技術(shù)[6]，始于20世紀(jì)60年代。1969年美國耶魯大學(xué)的Gall等[7]首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，將該基因進行定位，從而創(chuàng)造了原位雜交技術(shù)。此后，由于分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，特別是20世紀(jì)70年代末到80年代初，分子克隆、質(zhì)粒和噬菌體DNA的構(gòu)建成功，為原位雜交技術(shù)的發(fā)展奠定了深厚的技術(shù)基礎(chǔ)。

本研究以O(shè)IE標(biāo)準(zhǔn)中的派琴蟲PCR方法擴增獲得目的基因，進行地高辛標(biāo)記作為探針，在我國首次建立了派琴蟲的石蠟切片原位雜交檢測方法，并以O(shè)IE“金標(biāo)準(zhǔn)”RFTM培養(yǎng)法作為標(biāo)準(zhǔn)評價該方法的診斷特異性（Dse）和診斷敏感性（Dsp），同時應(yīng)用該方法檢測沿海隨機采集的貝類樣品。

1 材料與方法

1.1 樣品

待檢測樣品：采自中國黃海海域的菲律賓蛤、青蛤、文蛤、牡蠣。

對照樣品：本實驗室保存的預(yù)先經(jīng)鑒定感染包納米蟲的澳大利亞進口牡蠣[8]、采自我國廣西及東部沿海海域并經(jīng)鑒定感染尼氏單孢子蟲的牡蠣[9]、采用PCR加測序方法鑒定感染奧爾森派琴蟲[10]的菲律賓蛤仔和感染未定種派琴蟲[11]（687bp）的菲律賓蛤仔。

陽性樣品為RFTM檢測感染了派琴蟲的菲律賓蛤鰓和套膜組織；陰性樣品為RFTM檢測無派琴蟲感染的健康蛤鰓和套膜組織。

1.2 主要試劑、標(biāo)記試劑盒

Taq DNA聚合酶、dNTP購自寶生物工程（大連）有限公司；組織基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自QIAGEN（凱杰）公司；PCR DIG Probe Synthesis Kit購自德國Roche公司。

1.3 核酸探針的制備

1.3.1 引物設(shè)計合成

采用OIE推薦的根據(jù)派琴蟲ITS序列設(shè)計的特異性引物PerkITS85和PerkITS750進行PCR擴增反應(yīng)，預(yù)期擴增片段長度為673bp[2]，引物序列如下：

PerkITS-85：5’-CCGCTTTGTTTGGATCCC-3’

PerkITS-750：5’-ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3’

上述引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，用雙蒸水稀釋至10pmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴增目的基因序列

取感染派琴蟲的菲律賓蛤鰓組織25mg，采用Dneasy Blood&Tissue Kit（QIAGEN）按試劑盒說明提取基因組DNA，以引物PerkITS-85和PerkITS-750按照OIE推薦的反應(yīng)程序進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按照QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）的試劑盒說明回收DNA片段。

1.3.3 地高辛標(biāo)記派琴蟲目的基因序列

取回收獲得的DNA片段，采用Nanodrop-2000超微量核酸蛋白測定儀測定核酸含量，按PCR DIG Probe Synthesis Kit試劑盒說明進行標(biāo)記。

1.3.4 探針標(biāo)記效率與靈敏度測定

將對照DNA和標(biāo)記好的探針分別按照PCR DIG Probe Synthesis Kit試劑盒說明進行稀釋后，點樣于尼龍膜上，然后按試劑盒說明進行顯色。

1.3.5 探針特異性鑒定

采用Dneasy Blood&Tissue Kit（QIAGEN）按試劑盒說明提取對照樣品感染了包納米蟲的澳大利亞進口牡蠣、感染了尼氏單孢子蟲的我國廣西及東部沿海牡蠣、感染了奧爾森派琴蟲的菲律賓蛤仔和感染了未定種派琴蟲的菲律賓蛤仔的基因組DNA變性后，分別取5μL點樣于硝酸纖維膜上進行斑點雜交，檢測探針的特異性。

1.4 派琴蟲原位雜交檢測方法的建立

1.4.1 石蠟切片制備

取感染派琴蟲的菲律賓蛤仔鰓和套膜組織，用Davidson’s（或中性福爾馬林）固定液固定24h后，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、最后浸蠟包埋成蠟塊、切片（厚度為4μm），然后42℃展片到經(jīng)聚賴氨酸處理過的載玻片上，56℃烤片過夜。

1.4.2 切片預(yù)處理

用預(yù)雜交液代替探針作為陰性對照，將做原位雜交的切片置60℃烘箱中烘30min，然后進行常規(guī)脫蠟、水化處理；將組織切片放到0.125mg/mL的鏈霉蛋白酶溶液中消化（37℃，30min），然后用0.2%的甘氨酸終止反應(yīng)5min，用雙蒸水洗5min，再在4℃的0.4%甲醛中后固定5min，再用PBS洗5min，最后自然風(fēng)干。

1.4.3 原位雜交操作

將處理好的切片放入預(yù)熱的預(yù)雜交液中，42℃預(yù)雜交1h。預(yù)雜交結(jié)束后，倒掉預(yù)雜交液，加入新的預(yù)雜交液，并在其中加入探針，使探針濃度為2ng/μL，42℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，分別用含0.1%SDS的2×SSC和0.1×SSC在42℃各洗2次，每次15min；Washing Buffer中漂洗2次，每次10min；封閉液封閉30min；加抗體溶液室溫孵育1h；Washing buffer沖去抗體溶液，并漂洗15min，2次；Detection Buffer中平衡切片2～5min；每片加200mL顯色-酶作用底物溶液，置暗處顯色；顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)陽性信號（組織細胞中有藍紫色斑點），用TE-Buffer終止顯色；切片經(jīng)雙蒸水及50%、70%、90%、95%、100%乙醇逐級快速脫水，晾干后，用中性樹膠封片。

1.5 派琴蟲原位雜交檢測方法的評價

從待檢樣品中隨機抽取20個菲律賓蛤仔，按照文獻[2]介紹的RFTM培養(yǎng)方法進行派琴蟲檢測，同時留取蛤仔的鰓部和套膜按照1.4中的方法制備成石蠟切片，并進行預(yù)處理和原位雜交檢測，比較RFTM方法與原位雜交方法的檢測結(jié)果，并以RFTM方法為標(biāo)準(zhǔn)計算原位雜交檢測方法的診斷敏感性（Dse）和診斷特異性（Dsp）[12]。

1.6 派琴蟲原位雜交檢測方法的應(yīng)用

隨機采集中國黃海海域的菲律賓蛤20個，青蛤、文蛤以及牡蠣樣品各8個，打開貝殼，小心剪取樣品的鰓組織，將修剪下的鰓組織用Davision’s固定液過夜固定后，制備成石蠟組織切片進行原位雜交檢測，經(jīng)過切片的預(yù)處理、雜交、洗滌、顯色后，鏡下觀察不同種貝類產(chǎn)品的派琴蟲感染程度。

2 結(jié)果

2.1 派琴蟲ITS目的基因的PCR擴增

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并通過凝膠成像系統(tǒng)觀察后發(fā)現(xiàn)在673bp處有目的條帶（見圖1），將目的基因片段切膠回收，純化，并經(jīng)超微量分光光度計（Nanodrop-2000）檢測，派琴蟲的膠回收產(chǎn)物濃度為：1號樣品190 ng/ μL，2號樣品201ng/μL，將其作為標(biāo)記派琴蟲核酸探針的模板。

圖1派琴蟲PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 探針標(biāo)記效率與靈敏度檢測結(jié)果

探針標(biāo)記效率檢測結(jié)果如圖2所示。2號標(biāo)記的探針在0.1pg/μL稀釋濃度時顯色亮度和對照0.1pg/ μL稀釋的亮度相當(dāng)，推算出原標(biāo)記液中探針的含量可達到理論值2000ng；而1號標(biāo)記效率稍低，推算出探針含量為200ng。本研究采用2號探針進行進一步的研究，做Southern blot時，用雜交液將地高辛標(biāo)記的探針稀釋到25ng/mL使用，做切片原位雜交時，用雜交液將地高辛標(biāo)記的探針稀釋到2ng/μL使用。

圖2探針標(biāo)記效率檢測結(jié)果

2.3 探針特異性檢測結(jié)果

圖3探針特異性檢測結(jié)果

用制備的探針分別與包納米蟲、單孢子蟲、未定種派琴蟲以及奧爾森派琴蟲的DNA在硝酸纖維素膜上進行斑點雜交，結(jié)果見圖3。從圖中可以看出，1號奧爾森派琴蟲和2號未定種的派琴蟲雜交結(jié)果呈陽性，奧爾森派琴蟲的雜交信號較強，2號未定種的派琴蟲相對弱，牡蠣包納米蟲和尼氏單孢子蟲雜交結(jié)果呈陰性。說明該探針與單孢子蟲、包納米蟲等其他牡蠣常寄生性原蟲無交叉反應(yīng)，且在派琴蟲屬內(nèi)具有通用性。

2.4 派琴蟲石蠟切片原位雜交檢測結(jié)果

原位雜交結(jié)束后，顯色封片，顯微鏡下觀察整張片子，發(fā)現(xiàn)如圖4所示，箭頭所指處的藍紫色斑點——派琴蟲的特異性顯色，可判定樣品為派琴蟲感染陽性。

圖4 A 派琴蟲感染蛤仔鰓組織石蠟切片原位雜交

圖4 B 派琴蟲感染蛤仔套膜組織石蠟切片原位雜交

2.5 派琴蟲原位雜交檢測方法的評價結(jié)果

分別以瑞氏液體羥基乙酸鹽培養(yǎng)（RFTM）法和原位雜交法檢測隨機采集的20個樣品。檢測結(jié)果顯示，RFTM組織培養(yǎng)方法檢測出陽性11個，陰性樣品9個；原位雜交檢測方法檢測出陽性樣品10個（RFTM組織培養(yǎng)法陽性樣品中的10/11），陰性樣品10個（RFTM組織培養(yǎng)法陰性樣品中的9/9）（表1）。以RFTM方法為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)Dse和Dsp的計算公式得出本研究所建立的派琴蟲原位雜交檢測方法的DSe為90.9%，DSp為100%。

表1 RFTM培養(yǎng)法和原位雜交法的樣品檢測結(jié)果

2.6 派琴蟲原位雜交檢測方法的應(yīng)用

應(yīng)用本研究所建立的派琴蟲原位雜交檢測方法對采自中國黃海海域的菲律賓蛤、青蛤、文蛤以及牡蠣等樣品進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20份菲律賓蛤中，10份為派琴蟲感染陽性，10份為陰性；8份文蛤樣品中，2份為派琴蟲感染陽性，6份為陰性；8份青蛤和8份牡蠣樣品均為陰性，這從另一個角度也反應(yīng)了該原位雜交檢測方法與蛤仔和牡蠣組織均無交叉反應(yīng)，即沒有非特異性檢測結(jié)果出現(xiàn)。這表明本研究所建立的派琴蟲原位雜交檢測方法可以應(yīng)用于貝類及其產(chǎn)品的派琴蟲檢測。

3 討論

原位雜交技術(shù)的原理是依據(jù)核酸堿基互補配對原則，利用標(biāo)記的特定序列探針與待測樣本中的原位檢測目的基因互補核酸序列雜交，經(jīng)信號放大顯色后鏡下觀察結(jié)果[13]。原位雜交和免疫組織化學(xué)相似，可以顯示微生物病原在細胞內(nèi)的定位和分布，并且較免疫組織化學(xué)更具有特異性和敏感性，目前在感染性疾病、細胞遺傳性疾病和腫瘤三大類疾病[13]以及病毒[14]、寄生蟲[15-16]等病原微生物檢測方面，都有應(yīng)用原位雜交技術(shù)的成功經(jīng)驗。

本研究根據(jù)原位雜交的原理，利用OIE推薦的引物PerkITS-85和PerkITS-750進行PCR擴增，回收PCR產(chǎn)物進行地高辛標(biāo)記制備DNA探針，斑點雜交實驗結(jié)果證明該探針與單孢子蟲（Haplosporidium）、包納米蟲（Bonamia）等其他牡蠣常寄生性原蟲無交叉反應(yīng)，只對派琴蟲屬具有通用性。利用該探針在國內(nèi)首次成功建立了派琴蟲石蠟切片原位雜交檢測方法。該方法與OIE標(biāo)準(zhǔn)中推薦的原位雜交檢測方法有所不同，本研究中采用的是DNA探針，而OIE標(biāo)準(zhǔn)中采用的是根據(jù)派琴蟲小亞基rRNA設(shè)計的寡核苷酸探針，雖然寡核苷酸探針具有可以人工用DNA合成儀合成，其長度及分子大小比較一致，可以控制的優(yōu)點，但有些研究者認為寡核苷酸探針敏感度不如來自質(zhì)粒擴增的cRNA探針或DNA探針[17]，因此本研究選用了敏感度較高的DNA探針。而且所使用的通用引物PerkITS85/PerkITS750在派琴蟲屬內(nèi)有通用性，這在尚未明了感染派琴蟲種類的情況下，有利于盡可能多地檢獲派琴蟲病原。

本研究中將所建立的原位雜交檢測方法與以O(shè)IE推薦的RFTM培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)進行比較研究，得出原位雜交檢測方法的診斷敏感性為90.9%，診斷特異性為100%，可能由于RFTM培養(yǎng)方法會對腰鞭毛蟲產(chǎn)生交叉反應(yīng)[18]，而該方法避免了與腰鞭毛蟲產(chǎn)生交叉反應(yīng)的問題，同時還可以消除PCR等分子生物學(xué)假陽性率過高的影響，從而導(dǎo)致診斷敏感性較低，但由此也證實該方法能夠更加特異的檢出派琴蟲。此外，本研究還應(yīng)用該方法對我國黃海海域采集的蛤仔和牡蠣樣品的鰓及套膜組織的石蠟切片進行了派琴蟲檢測，結(jié)果表明本研究所建立的派琴蟲原位雜交檢測方法可以應(yīng)用于口岸貝類派琴蟲病的檢測。

綜上，本研究所建立的派琴蟲石蠟切片原位雜交檢測方法是一種有效的派琴蟲檢測方法，可以滿足國內(nèi)養(yǎng)殖場及進出口水生動物攜帶派琴蟲的檢測需求，有利于提高我國進出口貝類及其產(chǎn)品的質(zhì)量安全，提升我國水產(chǎn)品的國際貿(mào)易聲譽。

[1] Bower S M， Mcgladdery S E， Price I M. Synopsis of infections diseases and parasites of commercially exploited shellfsh [J]. Annu Rev Fish Dis， 1994， 4： 1-199.

[2] Wu S Q， Wang C X， Lin X M， et al. Infection prevalence and phylogenetic analysis of Perkinsus olseni in Ruditapes philippinarum from East China[J]. Dis Aquat Org， 2011， 96（1）：55-60.

[3] Dungan C F， Roberson B S. Binding specifcities of monoand polyclonal antibodies to the protozoan oyster pathogen Perkinsus marinus[J]. Dis Aquat Org， 1993， 15（1）：9-22.

[4] Bushek D， Dungan C F， Lewitus A J. Serological affnities of the oyster pathogen Perkinsus marinus （Apicomplexa） with some dinofagellates （Dinophyceae）[J]. J Eukaryot Microbiol，2002， 49（1）：11-16.

[5] Robledo J A F， Gauthier J D， Coss C A， et al. Speciesspecifcity and sensitivity of a PCR-based assay for Perkinsus marinus in the eastern oyster， Crassostrea virginica： a comparison with the fuid thioglycollate assay[J]. J Parasitol，1998， 84（6）：1237-1244.

[6] 蘇慧慈， 劉彥仿. 原位PCR[M]. 北京：科學(xué)出版社，1995.

[7] Gall J G， Pardue M L. Formation and detection of RNADNA hybrid molecules in cytological preparations[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 1969， 63（2）：378-383.

[8] Carnegie R， Barber B J， Culloty S C， et al. Development of a PCR assay for detection of the oyster pathogen Bonamia ostreae and support for its inclusion in the Haplosporidia[J]. Dis Aquat Org， 2000， 42（3）， 199-206.

[9] Stokes N A， Siddall M E， Burreson E M. Detection of Haplosporidium nelsoni （Haplosporidia， Haplosporidiidae） in oysters by PCR amplifcation[J]. Dis Aquat Org， 1995， 23（1）：145-152.

[10] Moss J A， Burreson E M， Reece K S. Advanced Perkinsus marinus infections in Crassostrea ariakensis maintained under laboratory conditions[J]. J Shellfsh Res， 2006， 25（1）： 65-72.

[11] Audemard C， Reece K S， Burreson E M. Real-time PCR for the detection and quantification of the protistan parasite Perkinsus marinus in environmental waters[J]. Appl Envrion Microbiol， 2004， 70（11）：6611-6618.

[12] World Organization for Animal Health （OIE）. Terrestrial Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines 2013[M]. Paris： World Organization for Animal Health， 2013.

[13] 孟麗. 原位雜交技術(shù)的應(yīng)用及操作體會[J]. 實用醫(yī)技雜志， 2012， 19（1）：94-95.

[14] 劉雯， 李勇， 張寧， 等. 豬圓環(huán)病毒2型原位雜交檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報， 2012， 32（1）：1-4.

[15] 王中衛(wèi)，呂昕，梁玉波.大連太平洋牡蠣體內(nèi)寄生蟲：沿岸單孢子蟲檢測[J].海洋環(huán)境科學(xué)， 2010， 29（3）：342-345.

[16] 史曉燕， 趙恒梅， 曾憲忠， 等. RNA原位雜交法檢測組織內(nèi)弓形蟲的試驗研究[J].中國人獸共患病雜志， 2004， 20（3）：214-216.

[17] Keller G H， Manak M M. DNA probe[M]. New York：Stockton Press. 1989.

[18] Almeida M， Berthe F， Thebault A， et al. Whole clam culture as a quantitative diagnostic procedure of Perkinsus atlanticus （Apicomplexa，Perkinsea） in clams Ruditapes decussates [J]. Aquaculture， 1999， 177：325-332.

Development and Application of an In-situ Hybridization Assay for Detection of Perkinsus spp. in Clams

Wang Caixia1，F(xiàn)eng Chunyan1，Yuan Xiangfen1，Deng Junhua1，Wang Zongxiang2，Wu Shaoqiang1
（1. Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100029；2. Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018）

In this study，the conserved ITS fragment of Perkinsus was amplified by PCR using the genus-specific PerkITS85 and PerkITS750 as primers. The purifed amplicons were digoxigenin-labeled and used as probes in the in-situ hybridizatio（SH）assay. Clam samples from the Yellow Sea were collected and screened by the developed ISH assay to confrm the perkinsus infection status. Results showed that a 673bp fragment of perkinsus ITS gene was successfully amplifed by PCR. The digoxigenin-labeled probe showed high specifcity， without cross-reaction with Bonamia ostreae and Haplosporidium nelsoni and other aquatic parasites. The OIE recommended Ray’s fluid thioglycollate medium（RFTM）culture assay was used as gold standard to evaluate the developed ISH assay，and it was found that the DSe of the ISH assay was 90.9%，and the DSp was 100%. Field application indicated that the developed ISH assay was an effective detection method for perkinsus and could be applied to perkinsus detection.

clam； Perkinsus；in-situ hybridization； Ray’s fuid thioglycollate medium（RFTM） culture assay； detection

S944.344

：A

：1005-944X（2014）06-0079-05