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（深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045）

傳染性造血器官壞死病毒的新型環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）熒光檢測技術(shù)

何俊強，史秀杰，盧體康，賈鵬，鄭曉聰，于力，蘭文升，王津津，劉葒

（深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045）

本研究建立了一種檢測傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）的新型熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法，為實驗室及現(xiàn)場檢測IHNV提供特異性強、靈敏度高、快速、能實時觀察擴增熒光信號的檢測技術(shù)。針對IHNV全基因組序列設(shè)計了一組6條LAMP特異性引物，對4株不同來源的IHNV和8株不同的病毒進行特異性實驗和靈敏度實驗，結(jié)果表明該方法具有高度特異性，檢測靈敏度可達3.64×10-7μg/μL，比常規(guī)RT-PCR高1000倍，與熒光RT-PCR方法相當(dāng)。通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）和熒光檢測技術(shù)相結(jié)合，使其檢測時間能縮短至15～20分鐘內(nèi)完成檢測，并可杜絕由于開蓋加染料而導(dǎo)致的假陽性率偏高問題，在魚病快速檢測上具有重要意義。

傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）；熒光檢測

傳染性造血器官壞死?。╥nfectious haematopoietic necrosis，IHN）是鮭鱒魚類的一種嚴(yán)重的傳染性疾病，常造成魚苗或幼魚70%～90%的死亡率，在某些病例中甚至接近100%，對世界鮭鱒魚類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。其病原為傳染性造血器官壞死病毒（IHNV），病毒粒子形態(tài)為彈狀，直徑80nm～90nm，長度為160nm～180nm，有囊膜，屬于魚類彈狀病毒（fsh rhabdovirus）[2]。由于該病對鮭鱒魚類養(yǎng)殖造成的巨大危害，目前該病被世界動物衛(wèi)生組織（OIR）列入水生動物疫病名錄，我國將其列為二類動物疫病。

起初IHN只流行于北美洲和歐洲部分地區(qū)，1968年該病隨紅大麻哈魚魚卵從阿拉斯加傳入日本北海道[3]，近來隨著水生動物及其產(chǎn)品進出口貿(mào)易的急劇增加，又傳入我國，并在我國局部地區(qū)流行[4]。目前常用于檢測感染和非感染狀態(tài)的IHNV的方法主要包括原位雜交、免疫組織化學(xué)、在體內(nèi)進行檢測的免疫金標(biāo)記方法[5]、ELISA[6]以及RTPCR[7]、熒光RT-PCR[8]等分子生物學(xué)方法。而檢測和診斷IHNV的經(jīng)典方法是利用魚類細胞系進行病毒分離，再通過抗體中和試驗確認(rèn)有無病毒。這種方法對于滴度較低的病毒感染很靈敏，但操作費時費力，通常在病毒感染很嚴(yán)重后才能出現(xiàn)明顯陽性結(jié)果。本研究利用新型的熒光檢測技術(shù)，成功建立了檢測IHNV的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）熒光檢測方法，能為實驗室和現(xiàn)場檢測提供一種更為快速和易于操作的檢測方法，對本病快速檢測具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒懸液

4株不同來源的傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）分別為：IHNV-UK和IHNV-32-87（英國CEFAS贈送）、IHNV-S（中科院水生所贈送）、IHNV-20130238（本實驗室分離保存）；4株同屬彈狀病毒科的粒彈狀病毒屬（novirhabdovirus）的水生動物病毒，分別為：鯉春病毒血癥病毒（spring viraemia of carpvirus，SVCV）、牙鲆彈狀病毒（hiramerhabdovirus，HRV）、病毒性出血性敗血癥病毒（viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV）、 狗 魚 幼 魚 彈 狀 病 毒（pike fryrhabdovirus，PFRV）[9]；4株常見的魚類病毒分別為：魚類病毒性神經(jīng)壞死病病毒（viral nervous necrosis virus，VNNV）、鰤魚腹水病毒（yellowtail ascites virus，YAV）、傳染性胰腺壞死病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）、傳染性鮭魚貧 血 病 病 毒（infectious salmon anaemia virus，ISAV）。其中SVCV、HRV、VHSV和VNNV病毒懸液均由本實驗室分離保存；YAV和IPNV由中科院水生所贈送；PFRV由德國慕尼黑大學(xué)贈送；ISAV由ISA挪威OIE參考實驗室贈送。

1.2 試劑

LAMP反應(yīng)試劑Isothermal Master Mix為英國OptiGene公司產(chǎn)品；核酸抽提使用QIAamp Viral RNA Mini Kit為QIAGEN公司產(chǎn)品；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、One Step RNA PCR Kit（AMV）、One Step PrimeScript RT-PCR Kit均為Takara公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）的全基因組序列（GenBankAccessionNo. X89213.1），使用LAMP Designer軟件（http：//www.optigene. co.uk/lamp-designer/）設(shè)計一組6條LAMP的特異性引物（表1）：正向外引物（F3）、反向外引物（B3）、正向內(nèi)引物（FIP）、反向內(nèi)引物（BIP）、環(huán)狀正向引物（LF）、環(huán)狀反向引物（LB）。

表1 IHNV環(huán)介導(dǎo)等溫擴增設(shè)計引物序列

1.4 病毒RNA提取

病毒RNA提取按照QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit（50）試劑盒使用說明書進行，RNA濃度使用Eppendorf BioPhotometer測定。熒光PCR和常規(guī)PCR靈敏度對比試驗使用同批次提取的核酸。

1.5 LAMP反應(yīng)

LAMP反應(yīng)使用OptiGene Isothermal Master Mix反應(yīng)試劑，25 μL反應(yīng)體系中包含：F3和B3引物各0.2 μmol/L，F(xiàn)IP和BIP引物各1.6 μmol/ L，LoopF和LoopB引 物 各0.8 μmol/L，1X的Isothermal Master Mix（包含BstTaq酶、dNTP、Mg2+及優(yōu)化LAMP反應(yīng)成分），AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2.5 U，2.5μL待測RNA模板。設(shè)置反應(yīng)梯度溫度61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃等8組溫度，放置預(yù)定時間（60min）。最后升高至98℃，以0.05℃/S的速度降溫至80℃做溶解曲線，反應(yīng)約6min終止反應(yīng)。實時觀察熒光信號的收集情況，通過熒光擴增曲線分析以確定最佳反應(yīng)條件，同時觀察溶解曲線峰值圖，確認(rèn)其特異性。最后將LAMP產(chǎn)物（5μL）用1.5%瓊脂糖凝膠電泳或加入核酸染料進一步確認(rèn)。

1.6 RT-PCR反應(yīng)

使用1對IHNV特異性引物（正向引物5’-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3’；反 向 引 物5’-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTGCAA-3’）[10]進行RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR使用Takara One Step RNA PCR Kit（AMV）反應(yīng)試劑盒，50μL反應(yīng)體系中包含：1×buffer，0.5mmol/ L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，40 μmol/L正向引物，40 μmol/L反向引物，Taq酶5 U，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5 U，RNA酶抑制劑40 U，2.5 μL待測RNA模板，DEPC水補足25μL。設(shè)置反應(yīng)程序：50℃30min； 95℃ 2min；之后95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min進行30個循環(huán)；再72℃ 7min ；4℃保存。最后將RT-PCR產(chǎn)物（5 μL）用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳進行判斷，擴展693 bp大小為陽性。

1.7 實時熒光RT-PCR反應(yīng)

使用1對IHNV特異性引物（正向引物5’-GGT-CGC-CGA-ACT-TCT-GGA-A-3’；反向引物5’-GTG-CCC-CAG-TGT-CCA-AAG-A-3’），及1條IHNV特異性探針（探針5’-FAM-CCCTGG-GCT- TCT-TGC-TGG-A-TAMRA-3’）[11]進行熒光RT-PCR反應(yīng)。熒光RT-PCR使用Takara One Step PrimeScript RT-PCR Kit反應(yīng)試劑盒，25 μL反應(yīng)體系中包含：1X One Step RT-PCR BufferⅢ（包含dNTP Mixture，Mg2+以及優(yōu)化的PCR反應(yīng)成分），1X Rox Reference DyeⅡ，1X PrimeScript RT Enzyme MixⅡ，EX Taq HS（2.5 U），0.2 μmol/L正向引物，0.2 μmol/L反向引物，0.1 μmol/L探針， 2.5μL待測RNA模板，DEPC水補足25μL。設(shè)置反應(yīng)程序：50℃ 2min；95℃10min；之后95℃ 15s，60℃ 1min，進行40個循環(huán)；通過熒光PCR儀收集熒光信號后判斷。

1.8 IHNV LAMP靈敏度測定實驗

將IHNV-20130238核酸（36.4 μg/μL）10倍系列稀釋的每個稀釋度作為反應(yīng)模板。使用優(yōu)化后的LAMP方法來測定其檢測下限。同時使用相同稀釋度的模板（2.5 μL）進行RT-PCR和熒光RTPCR檢測，對比三種方法的檢測靈敏度。

1.9 IHNV LAMP特異性檢測實驗

使用優(yōu)化后的LAMP方法，對4株不同來源的IHNV和8種其他水生動物病毒（SVCV、HRV、VHSV、PFRV、VNNV、YAV、IPNV、ISAV）模板進行特異性實驗。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)優(yōu)化

使用IHNV-32-87（0.5 μg/μL）作為模板進行LAMP反應(yīng)，以確定最佳的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間。于61℃- 68℃進行梯度擴增，其中62℃～67℃LAMP擴增的峰值強度和峰值時間均比較穩(wěn)定，以最早的峰值時間（PeaksPositor）作為判斷依據(jù)，66℃時峰值時間最早為15：36（圖1a-b）。因此，選擇66℃作為最佳溫度。為保證反應(yīng)體系中低濃度模板也能檢出陽性，故選擇60min作為優(yōu)化后的反應(yīng)時間。

2.2 IHNV-LAMP靈敏度對比實驗

圖1 IHNV反應(yīng)溫度梯度實驗

IHNV-LAMP檢測方法使用6條引物，在66℃下反應(yīng)60min，測定其檢測下限。LAMP反應(yīng)、RT-PCR和熒光RT-PCR使用2.5μL相同稀釋倍數(shù)的IHNV-20130238核酸（36.4μg/μL）作為模板。LAMP檢查IHNV-20130238的極限為10-6（約3.64×10-7μg/μL）（圖2a-b），熒光RT-PCR檢測極限為10-6（約3.64×10-7μg/μL）（圖2c），RT-PCR檢測極限為10-3（約3.64×10-4μg/μL）（圖2d）。結(jié)果表明，LAMP檢測靈敏度是與熒光RT-PCR的靈敏度相當(dāng)，是普通RT-PCR靈敏度的1000倍。

2.3 IHNV-LAMP的特異性檢測實驗

使用LAMP方法對4株不同來源的IHNV，4種同屬水生動物彈狀病毒SVCV、HRV、VHSV、PFRV，和4種無關(guān)魚病VNNV、YAV、IPNV、ISAV提取的核酸進行特異性反應(yīng)。其中4株不同來源的IHNV均能擴增。4株IHNV的峰值時間（PeaksPositor） 分別為13∶33、10∶33、9∶18、14∶48。其他8種病毒均無擴增（圖3a-b）。結(jié)果表明，LAMP檢測IHNV的方法具有很好的特異性。

3 討論

IHNV是海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中最嚴(yán)重的病毒性病原之一。20世紀(jì)四、五十年代， IHN在美國首次暴發(fā)。最初主要對北美太平洋沿岸養(yǎng)殖的鮭科魚類造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[12]。但隨著各國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和水產(chǎn)品貿(mào)易的開展，IHNV不斷蔓延，給各國淡海水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大危害。目前，IHNV已經(jīng)蔓延至臺灣、日本、意大利、英國、法國、中國和韓國等國家和地區(qū)，感染魚類包括虹鱒（Oncorhynchusmykiss）、紅大麻哈魚（O.nerka）、大麻哈魚（O. keta）、大鱗大麻哈魚（O. tshawytscha）、細鱗大麻哈魚（O.gorbuscha）、銀大麻哈魚（O.kisutch）、馬蘇大麻哈魚（O.masou）、玫 瑰 大 麻哈 魚（O. rhodurus）、 大西 洋 鮭（Salmosalar）、 河 鱒（S.trutta）、 太 平 洋 鯡（Clupeapallasi）和管吻刺魚（AuLorhynchusfavidus）等[13-16]。目前一些用于檢測感染和非感染狀態(tài)的方法主要包括原位雜交、免疫組織化學(xué)、在體內(nèi)進行檢測的免疫金標(biāo)記方法、ELISA以及RT-PCR、熒光RT-PCR等分子生物學(xué)方法。

圖2 IHNV靈敏度測定對比實驗

圖3 IHNV特異性檢測實驗

近年來環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）已被開發(fā)應(yīng)用[17]，國內(nèi)外已建立多種重要經(jīng)濟水生動物病毒感染的LAMP檢測方法[18-21]。其采用特異性識別靶序列上的6個位點的4條引物，及一種具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件進行核酸指數(shù)級擴增，在擴增反應(yīng)中產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)，引物與其雜交啟動新的一輪核酸合成[22]。最后利用熒光染料直接染色，并通過核酸染料顏色的變化來判定[23]，或使用溴化乙錠凝膠電泳方法觀察。還有一種方法是通過濁度分析儀來檢測LAMP的焦磷酸鹽沉淀來判定LAMP檢測結(jié)果[24]。但在實際中使用該方法的檢測靈敏度不如熒光染料法和電泳法，靈敏度相差達100倍以上[25]。

LAMP具有等溫擴增、高效靈敏、特異性高、檢測快速、對儀器要求低、操作簡便等特點，十分適合在野外漁場開展檢測。但對于相對封閉的環(huán)境中如檢測實驗室等檢測時，其需要在LAMP反應(yīng)后開蓋加入核酸染料來進行判定，由于LAMP方法的高效擴增性，使得在封閉環(huán)境中很容易形成帶有相關(guān)核酸片段的氣溶膠，造成長期檢測相同項目時容易出現(xiàn)假陽性率偏高的情況。這也是目前阻礙LAMP檢測技術(shù)全面推行的主要瓶頸。

本研究采用熒光檢測技術(shù)對LAMP的擴增產(chǎn)物進行熒光收集，使用488nM激發(fā)光源，520nM發(fā)射熱循環(huán)熒光監(jiān)測，實時收集記錄LAMP反應(yīng)擴增的熒光信號，得到類似于熒光PCR的“S”型擴增曲線，能直觀的觀察到待測樣品的檢測結(jié)果。通過溶解曲線分析，還可進一步確認(rèn)其擴增的特異性。在特異性實驗檢測中，我們利用了4株不同來源的IHNV與4種同屬水生動物彈狀病毒（SVCV、HRV、VHSV、PFRV）提取的核酸，以及4種無關(guān)魚?。╒NNV、YAV、IPNV、ISAV）提取的核酸進行特異性實驗。同屬水生動物彈狀病毒以及其他無關(guān)的魚類病毒均無擴增，4株IHNV均能在短時間內(nèi)檢測出來，峰值時間（PeaksPositor）分別為13∶33、10∶33、9∶18、14∶48。可見一般在10～20分鐘內(nèi)可完成檢測，相對普通RT-PCR和熒光RTPCR方法至少需要2～3小時，和傳統(tǒng)LAMP檢測需要45～60分鐘來說，本研究能在更短的時間完成IHNV的LAMP檢測。這主要得益于我們采用了更為靈敏的熒光檢測技術(shù)作為數(shù)據(jù)讀取的手段，通過熒光的疊加收集，能更快、更及時的反映樣品檢測情況，故能更早的發(fā)現(xiàn)其擴增產(chǎn)物。

在做靈敏度測試實驗時，我們使用相同稀釋倍數(shù)的IHNV-20130238核酸（36.4μg/μL）作為模板，分別與普通RT-PCR和熒光RT-PCR作對比實驗，通過軟件分析我們得出等同于熒光PCR“CT值”的出峰值時間（PeaksPositor），結(jié)果表明本研究LAMP檢測下限可達3.64×10-7μg/μL。檢測靈敏度與熒光RT-PCR靈敏度相當(dāng)，是普通RT-PCR靈敏度的1000倍。

最后，針對IHNV本研究建立的LAMP熒光檢測技術(shù)，是一種全新改進的恒溫核酸擴增方法，與其他分子生物學(xué)檢測及時相比，其操作更為簡便和更為快速。同時改進了傳統(tǒng)LAMP染料法觀察需要開蓋加核酸染料的弊端，能杜絕假陽性的出現(xiàn)，并能做到實時分析。是一種靈敏、特異、快速，十分有效的新型檢測方法。

[1] 孟兆娜，劉敏.傳染性造血組織壞死病病毒（IHNV）的流行病學(xué)及檢測技術(shù)研究進展[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2010（11）：50-52.

[2] 劉葒，范萬紅，史秀杰等.國內(nèi)養(yǎng)殖魚類和進境魚卵中傳染性造血器官壞死病毒（IHNV） 的檢測及基因分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，25（5）： 544-549.

[3] Sano T， Nishimura T， Okamoto N， et al. Studies on Viral Diseases of Japanese Fishes. VI. Infectious hematopoietic necrosis （ IHN） of samonids in the mainland of Japan [J]. J Tokyo Univ Fish， 1977， 63（2）：81-85.

[4] 牛魯祺，趙志壯. 東北地區(qū)虹鱒IHN和IPN流行病學(xué)的初步研究[J].水產(chǎn)學(xué)報，1988，12（4）：327-332.

[5] Drolet BS， Chiou PP， Heidel J， et al. Detection of Truncated Virus Particles in a Persistent RNA Virus Infection in Vivo[J]. Virol， 1995， 69（4）：2140-2147.

[6] Dixon P F， Hill B J.Rapid Detection of Fish Rhabdoviruses by the Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay （ ELISA） [J]. Aquac， 1984， 42（1） ：1-12.

[7] Pinwen P C，Barbara S D，Jo-Ann C L.Polymerase Chain Amplifcation of Infectious Hematopoietic Necrosis Virus RNA Extracted from Fixed and Embedded Fish Tissue [J]. J Aqua Ani Heal， 1995， 7（1）：9-15.

[8] Overturf K， Lapatra S， Powell M. Real-time PCR for the Detection and Quantitative Analysis of IHNV in Salmonids[J]. J Fish Dis，2001， 24（6）：325-333.

[9] 阮紅梅， 張奇亞.魚類彈狀病毒分子生物學(xué)研究動態(tài)[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2003，10（6）：513-519.

[10] World Organization for Animal Health（OIE）. Infectious Hamatopoietic Necrosis Virus[M/OL]//Maunal of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2012.（2013 ed：300-313）. http：//www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/ aahm/2010/2.3.04_IHN.pdf

[11] 岳志芹，劉葒，梁成珠等.實時定量RT-PCR檢測魚類傳染性造血器官壞死病毒方法的建立與應(yīng)用[J].水生生物學(xué)報，2008，32（1）：91-95

[12] Williams I V， Amend D F. A Natural Epizootic of Infectious Hematopoietic Necrosis in Fry of Sockeye Salmon（Oncorhynchusnerka） at Chilko Lake， British Columbia [J]. J Fish Res BdCan， 1976， 33（7） ：1564-1567.

[13] Follett J E， Thomas J B， Hauck A K. Infectious hematopoietic necrosis virus in moribund and dead juvenile chum， Oncorhynchusketa（ Walbaum ） and chinook， O.tshaw y tscha（Walbaum）， salmon and spawning adult salmon at an Alaskan hatchery[J ]. J Fish Dis，1987， 10（4） ：309-313.

[14] Bootland I M，Leong J C. Infectious Hematopoietic Necrosis Virus[M]/ / Woo PTK， Bruno DW. Fish Disease and Disorders. Volume 3： Viral， Bacterial and Fungal Infections. New York：CAB International， 1999： 57-121.

[15] Wolf K. Fish Viruses and Fish Viral diseases [M]. NewYork：Cornell University Press， 1988.

[16] Kent M L， Traxler G S， Kieserd D， et al. Survey of Salmonid Pathogens in Ocean-Caught Fishes in Britich Columbia，Canada[J]. J Aquatic Animal Health， 1998， 10（2）：211-219.

[17] Notomi T， Okayama H， Masubuchi H， et al. Loop-Mediated Isothermal Amplifcation of DNA[J]. Nucleic Acids Res，2000， 28（12）： 63.

[18] Savan R， Kono T， Irami T， et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification： An Emerging Technology for Detection of Fish and Shellfish Pathogens [J]. J Fish Dis，2005， 28 （10）： 573-581.

[19] Nagamine K， Hase T， Notomi T. Accelerated Reaction by Loop-Mediated Isothermal Amplifcation using Loop Primers [ J]. Mol Cell Probes， 2002， 16 （3）： 223-229.

[ 20] Liu Z， Teng Y， Xie X，et al. Development and Evaluation of a One-Step Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detection of Spring Viraemia of Carp Virus[J]. Journal of Applied Microbiology， 2008，105（4）： 1220-1226.

[21] Gunimaladeci I，KonoT，LaPatra SE，et al. A Loop Mediated Isothermal Amplification（LAMP） Method for Detection of Infectious Hematopoietic Necrosis Virus（IHNV）in Rainbow Trout（Oncorhynchusmykiss）[J]. Archives of Virology， 2005，150（5）：899-909.

[22] 趙飛， 鄒為民. LAMP法在水產(chǎn)動物病原快速檢測中的應(yīng)用[J].南方水產(chǎn)， 2007， 3（2）：71-75.

[23] Iwamoto T， SonobeT， Hayashi K. Loop-Mediated Isothermal Amplifcation for Direct Detection of Mycobacterium TubercuLosis Complex， M.avium， and M. intracellu Lare in Sputum Samples [ J]. J Clin Microbiol，2003， 41（6）： 2616- 2622.

[24] Mori Y， Nagamine K， Notomi T， et al. Detection of Loop-Mediated Isothermal Amplifcation Reaction by Turbidity Derived from Magnesium Pyrophosphate Formation [J]. BiochemBiophys Res Commun， 2001， 289 （1）： 150 -154.

[25] Mao X L， Zhou S， Xu D，et al. Rapid and Sensitive Detection of Singapore Grouper Iridovirus by Loop-Mediated Isothermal Amplifcation[J]. Journal of Applied Microbiology，2008，105（2）：389-397.

A novel loop-mediated isothermal amplifcation assay for the detection of infectious haematopoietic necrosis virus

He Junqiang，Shi Xiujie，Lu Tikang，Jia Peng，Zheng Xiaocong，Yu Li，Lan Wensheng，Wang Jinjin，Liu Hong
（Animal & Plant Inspection and QuarantineTechnology Center，Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518045）

A loop-mediated isothermal amplifcation assay（LAMP）for the detection of infectious haematopoietic necrosis viru（IHNV was established in this study. This novel method could be used in IHNV detection with high specifcity，sensitivity and rapidity both in the laboratory and feld conditions. A set of 6 LAMP primers were designed based on IHNV genome sequence. 4 IHNVstrains from different sources and 8 other viruses were involved in specifcity and sensitivity tests. The results indicated that the specifcity was high，and the detection limit was 3.64×10-7μg/μL，1000 fold higher than the conventional RT-PCR and same as real-time RT-PCR. The combination of LAMP and real-time RT-PCR could decrease the required detection time to 15-20 min and reduce the false positive rate caused by lid opening.

infectious haematopoietic necrosis virus（IHNV）；loop-mediated isothermal amplification assay（LAMP）；fuorescence detection

S851.347.34；S941.414

：A

：1005-944X（2014）06-0068-06

質(zhì)檢公益性行業(yè)專項（201210055和201210214）；質(zhì)檢總局科研項目（2012IK032）

劉葒liuhong@szciq.gov.cn