胡 雯 雯，曹 方，欒 靜，孫 玉 梅

（大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

已檢測出的影響啤酒風味的化合物主要有20余種高級醇和高級酯［1－2］。啤酒風味成分含量低微，通常需要先處理樣品再行氣相色譜儀分析。目前的樣品處理方法主要有溶劑萃取、萃取并蒸餾、超臨界流體萃取和靜態(tài)頂空進樣等。這些方法都存在缺陷，如操作繁瑣、定量困難、技術要求高、設備昂貴等［3］。固相微萃取集采樣、萃取、濃縮于一體，具有操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點［4］。相關研究顯示，風味閾值和含量較高的乙醛、二甲基硫醚、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、己酸乙酯和辛酸乙酯等化合物對啤酒風味影響較大，是啤酒香味成分的主要骨架［5－6］。用65μm PDMS／DVB萃取頭進行風味物質萃取和測定，效果較好［7－8］。作者采用HS－SPME－GC法測定啤酒中主要風味成分，以模擬酒樣為試樣，采用響應面法分析，以得到HS－SPME萃取啤酒風味成分的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

乙醛、二甲基硫醚、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯，色譜純（純度＞99%），天津基準化學試劑有限公司；氯化鈉，分析純，天津霸州市化工分廠。

1.1.2 儀 器

65μm PDMS／DVB固相微萃取頭及手動進樣手柄，Suplco；85－2型恒溫磁力攪拌，鞏義市英峪予華儀器廠；15mL SPME樣品瓶，上海安譜公司；GC－8900型氣相色譜儀，山東經(jīng)緯分析儀器有限責任公司；N2000 色譜工作站，浙江大學智達信息工程有限公司。

1.2 模擬酒樣的制備

準確量取二甲基硫醚100μL 和乙酸異丁酯50μL，分別用4%乙醇溶液定容至25 mL。于100mL容量瓶中準確添加乙醛39μL、正丙醇93μL、異丁醇93μL、異戊醇180μL、乙酸乙酯90μL、乙酸異戊酯24μL、己酸乙酯10μL、辛酸乙酯10μL，再添加上述稀釋后的二甲基硫醚125μL和乙酸異丁酯250μL，4%乙醇溶液定容至刻度［5－6］。

上述混合溶液即為模擬酒樣，依次稀釋0、5、10、50、100、500、1 000、1 250、1 500和2 000倍，制作標準曲線。

1.3 HS－SPME的萃取條件

試樣預先在4 ℃冰箱冷藏過夜。在15 mL樣品瓶中依次加入適量NaCl、7mL試樣和轉子，用PTFE墊密封，在一定溫度的攪拌環(huán)境下平衡一段時間，迅速將SPME 萃取頭穿過密封墊插入樣品瓶，懸于頂空部分，推出萃取頭使其暴露于樣品瓶的頂空部分，萃取一定時間。萃取結束后，縮回萃取頭，立刻取下插入氣相色譜儀進樣口解析一段時間。

1.4 氣相色譜條件

采用FFAP石英毛細管色譜柱（30m×0.32mm，0.5μm）；起始溫度40 ℃，保持2min，以8 ℃／min升至130℃，保持5min；FID 檢測器；載氣為N2，柱前壓0.1MPa；進樣口溫度為250℃，檢測器溫度為250 ℃。

1.5 Plackett－Burman設計篩選影響萃取條件的顯著性因素

采用Plackett－Burman（PB）設計法考察樣品體積X1（mL）、攪拌轉數(shù)X2（r／min）、NaCl質量濃度X3（g／mL）、解析時間X4（min）、萃取溫度X5（℃）、平衡時間X6（min）、萃取時間X7（min）對萃取效率的影響［6］，通過Minitab 15數(shù)據(jù)處理軟件以峰面積（Y）大小為響應值考察各因素對萃取峰面積影響的顯著性。

1.6 最陡爬坡試驗

以PB試驗篩選的顯著因素試驗值變化的梯度方向為最陡爬坡試驗的爬坡方向，根據(jù)各因素效應值確定變化步長，優(yōu)化萃取條件，快速逼近最佳區(qū)域。

1.7 響應面分析

在最陡爬坡試驗基礎上確定Box－Behnken（BB）試驗的中心點，通過響應面分析法設計并試驗，采用多元二次方程擬合因素與響應值間函數(shù)關系，進一步優(yōu)化多因素變量。

2 結果與討論

2.1 Plackett－Burman設計篩選影響萃取條件的顯著性因素結果

以峰面積為響應值，考察影響HS－SPME 萃取條件的7個主要因素。試驗設計及結果如表1和表2所示。由結果可知，X3、X5和X7對Y影響顯著，所以進一步優(yōu)化這3個因素。NaCl質量濃度對萃取峰面積變化有顯著正效應，萃取溫度和萃取時間有顯著負效應。為提高萃取峰面積，應加大NaCl的質量濃度，降低萃取溫度和萃取時間。

表1 Plackett－Burman試驗設計及結果（N＝12）Tab.1 Experimental design and results of Plackett－Burman（N ＝12）

2.2 最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗篩選出的3個顯著因素的效應和比例設計最陡爬坡路徑。設定萃取溫度步長4 ℃、萃取時間步長5 min、NaCl質量濃度步長0.143g／mL進行最陡爬坡試驗。設計及結果如表3所示。最優(yōu)萃取條件在試驗組2和試驗組4之間，故以試驗組3的條件為響應面試驗的中心點。

表2 Plackett－Burman 試驗設計的因素水平及其效應分析Tab.2 Levels of variables and analysis of the effect of Plackett－Burman design

表3 最陡爬坡試驗設計及其結果Tab.3 The design and results of steepest ascent test

2.3 Box－Behnken試驗設計及結果

在最陡爬坡試驗的基礎上，以試驗組3的條件為中心點，采用三因素三水平的響應面分析法進行試驗，運用Minitab 15數(shù)據(jù)處理軟件進行回歸分析。試驗因素水平見表4，試驗設計及結果見表5，結果分析見表6。

表4 Box－Behnken試驗設計的因素與水平Tab.4 Experimental factors and levels of Box－Behnken design

通過Minitab 15軟件分析，建立二次響應面回歸模型，確定峰面積的預測值對萃取溫度、萃取時間、NaCl質量濃度的多元二次回歸方程為Y＝6.093 3－0.323 8A＋0.285 0B＋0.321 3C－0.381 7A2－0.329 2B2－1.286 7C2＋0.402 5AB＋0.130 0AC－0.112 5BC。其中：Y為10種風味成分產(chǎn)生的峰面積總和，A、B、C分別代表萃取時間（min）、萃取溫度（℃）和NaCl質量濃度（g／mL）。

表5 Box－Behnken試驗設計及結果Tab.5 Experimental design and results of Box－Behnken

表6 模型的方差分析Tab.6 Variance analysis of model

由表6可知，模型回歸的P＝0.001，失擬項的P＝0.010，說明模型回歸顯著，失擬不顯著，模型模擬較好，不需要再引入更高次數(shù)的項。模型的校正相關系數(shù)的平方R2＝98.04%，表明多元二次回歸方程的擬合程度較好，萃取峰面積與萃取的條件呈線性關系。因此該模型選擇正確，可用于HS－SPME條件優(yōu)化的理論預測。

2.4 最優(yōu)條件的確定及響應曲面和等高線分析

利用回歸方程求得各因素的最優(yōu)條件，對回歸方程求一階偏導數(shù)等于0，得到方程：

－0.763 4A＋0.402 5B ＋0.13C－0.323 8＝0 0.402 5A－0.658 4B－0.112 5C ＋0.285 0＝0 0.13A－0.112 5B－2.573 4C ＋0.321 3＝0

對方程組聯(lián)立求解，得出模擬方程的極值點：A＝－0.276，B＝0.247，C＝0.100。因此固相微萃取的最優(yōu)條件為：15mL樣品瓶中加入7mL萃取液并添加0.287g／mL 氯化鈉，在48.90 ℃環(huán)境下萃取45.12 min，由線性回歸方程可以確定最大萃取峰面積為6.19×104。在上述萃取條件下進行驗證性試驗，測得峰面積的平均值為6.20×104，與回歸方程預測結果的誤差為0.16%，表明該回歸方程能夠準確地預測試驗結果。

對表5的試驗結果進行分析，繪制響應曲面及等高線圖，見圖1。由圖可知，兩因子間均成拋物線性關系，有一個極大值，由等高線為橢圓形可直觀地看出各因子間的交互影響顯著。

圖1 響應曲面及等高線圖Fig.1 Response surface plot and contour plot

由圖1（a）可知，當萃取溫度在46～52 ℃時，隨著萃取時間的增加，萃取峰面積逐漸增大，當萃取溫度超過52 ℃時，萃取峰面積有下降趨勢。由于溫度升高，被萃取物的擴散系數(shù)增大，擴散速度加快，平衡時間縮短；溫度過高可能影響某些揮發(fā)性組分的穩(wěn)定性，還會使萃取頭的萃取效率下降［6］。

由圖1（b）可知，當萃取溫度在46～51.2 ℃、7mL樣品中添加0.250～0.357g／mL NaCl時，萃取峰面積有最大值（6.0×104以上），繼續(xù)增加NaCl的質量濃度，則會造成萃取峰面積逐漸下降。增加溶液中的離子強度，會降低被萃取物在溶液中的溶解度，起到鹽析作用，有利于被萃取物在涂層上的萃取。NaCl的質量濃度達到飽和點，會引起酯類物質響應值降低，干擾峰增多且產(chǎn)生拖尾峰。

由圖1（c）可知，7 mL 樣品中添加0.250～0.343g／mL NaCl時，NaCl的質量濃度和萃取時間能較顯著地影響萃取峰面積。

2.5 固相微萃取優(yōu)化條件的有效性驗證

在最優(yōu)萃取條件下測定模擬酒樣中的風味成分，通過改變風味成分濃度，經(jīng)HS－SPME－GC萃取分析，建立檢測峰面積與實際濃度之間的線性回歸方程（表7）。

由表7可見，該方法在一定質量濃度范圍內啤酒中有較好的線性關系，回歸方程相關系數(shù)R2為97.87%～99.96%，回收率為91.20%～103.46%，標準偏差為1.74%～8.90%，試驗精密度較高，說明該方法能較準確地定量分析啤酒中風味成分。

2.6 成品啤酒樣品分析

用建立的HS－SPME方法處理3種市售成品啤酒，通過氣相色譜法檢測10 種風味成分的含量，結果見表8，啤酒樣品的典型色譜圖見圖2。由表8可知，HS－SPME－GC法能有效地檢測成品啤酒中乙醛、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、異戊醇、己酸乙酯和辛酸乙酯9種風味成分，由于二甲基硫醚主要存在于大麥芽中，在啤酒中含量甚微（2μg／L），可能是所用的檢測器靈敏度達不到這個數(shù)量級，所以此法未檢出市售啤酒中的二甲基硫醚含量。測定的3種不同品牌啤酒樣品中含有的揮發(fā)性風味成分各不相同，可能與原料和釀造工藝的不同有關。

表7 HS－SPME－GC檢測模擬酒樣中10種風味組分的線性范圍及回收率Tab.7 Linear range and coefficient of recovery of ten flavor components in synthetic beer sample detected by HS－SPME－GC

表8 成品啤酒中風味成分的質量濃度Tab.8 Concentration of flavor compounds in beer samples

圖2 啤酒樣品的典型色譜圖Fig.2 Typical chromatogram of beer samples

3 結 論

運用Plackett－Burman法篩選出萃取溫度、萃取時間和NaCl質量濃度對HS－SPME 萃取效率影響顯著，由最陡爬坡試驗確定了顯著因素的最佳范圍，再利用Box－Behnken法設計試驗進一步優(yōu)化，Minitab軟件進行回歸分析確定最優(yōu)萃取條件：15mL樣品瓶中加7mL萃取液并添加0.287g／mL氯化鈉，在48.90 ℃環(huán)境下萃取45.12min。驗證性試驗誤差為0.16%。在最優(yōu)萃取條件下，利用HS－SPME－GC法分析模擬酒樣，回收率較高，標準偏差較小，重現(xiàn)性好，精密度高，能夠快速、準確、靈敏、安全地應用于啤酒風味成分的定量分析。

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