周 廣 麒，陳 成，齊 文 茂，曹 照 平，張 偉 麗，任 彩 俠

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

葡萄酒工廠將葡萄壓榨后會(huì)產(chǎn)生大量皮渣，通常有兩種處理方法：一是作為粗飼料出售，不做加工，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較低；二是作肥料傾倒或掩埋，但容易滋生病菌，污染環(huán)境。

葡萄皮渣中含有較多的纖維物質(zhì)，能快速通過(guò)豬的胃腸，導(dǎo)致養(yǎng)分的吸收利用率降低，因此會(huì)降低飼料利用效率［1］。纖維素酶和木聚糖酶等組成的復(fù)合酶不但能降低粗纖維的含量，還能消除抗氧化因子，有效提高飼料的適口性和飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［2］，對(duì)仔豬的生長(zhǎng)也具有較大的促進(jìn)作用［3］。飼料中添加酵母菌已被廣泛的應(yīng)用［4］，酶解后所產(chǎn)生的糖可用于酵母菌的生長(zhǎng)，不僅可以提高飼料蛋白的品質(zhì)［5］，還能產(chǎn)生香味物質(zhì)，促進(jìn)豬的食欲。增加葡萄皮渣在配合飼料中所占的比例能降低飼料的成本，增加效益；但是比例過(guò)大，也會(huì)降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的均衡以及飼喂的效果［6］，所以選擇合適的配合比例至關(guān)重要。本研究將葡萄皮渣與輔助農(nóng)副產(chǎn)品豆粕、麩皮和玉米面等配合，經(jīng)由復(fù)合酶降解和酵母發(fā)酵獲得多量的細(xì)胞蛋白，依據(jù)豬飼料國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制成配合飼料。

1 材料與方法

1.1 材 料

葡萄皮渣，遼寧五女山米蘭酒業(yè)有限公司；豆粕、麩皮，大連棒棰島食品集團(tuán)調(diào)味食品廠；玉米面，市售；復(fù)合酶（纖維素酶和木聚糖酶等），黑龍江肇東國(guó)科酶制劑有限公司；釀酒酵母，廣東丹寶利酵母有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄皮渣飼料發(fā)酵工藝

原料→篩選→混合→加水→潤(rùn)料→滅菌→冷卻→加酶→翻拌→降溫→接種酵母→發(fā)酵→干燥→粉碎→成品。

1.2.2 操作要點(diǎn)

原料處理：剔除葡萄皮渣中的土塊、石頭等雜物。

原料混合：將原料葡萄皮渣、豆粕、麩皮和玉米面等按一定比例混合。

潤(rùn)料：原料與水按照質(zhì)量比2∶1充分潤(rùn)透，混合均勻，要求散而不凝，沒(méi)有結(jié)團(tuán)。

滅菌條件：121 ℃蒸汽滅菌60min。

加入復(fù)合酶：將滅菌后的原料冷卻至室溫，于無(wú)菌室中加入復(fù)合酶。加酶量分別為：纖維素酶2.0、2.5、3.0U／g；木聚糖酶5、6、7U／g。

酶解：在50℃下恒溫72h，每日晃瓶2次，使發(fā)酵物松散、均勻。

接種活化酵母：活性干酵母按0.05%加入，使用前取適量無(wú)菌水，25 ℃活化2h。

酵母發(fā)酵：在30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵96h。

熱風(fēng)干燥：將發(fā)酵飼料攤于淺盤中，50 ℃熱風(fēng)風(fēng)干12～24h。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 水分的測(cè)定

根據(jù)GB／T 6435—2006采用直接干燥法。

1.3.2 蛋白質(zhì)的測(cè)定

采用微量凱式定氮法［7］。

1.3.3 粗纖維的測(cè)定

根據(jù)GB／T 6434—2006采用過(guò)濾法。

1.3.4 灰分的測(cè)定

根據(jù)GB／T 6438—2007采用灼燒法。

1.3.5 還原糖得率

采用DNS法［8－9］測(cè)定水解液中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)：將試樣放置在50 ℃的烘箱中12h，粉碎均勻后精確稱取1.000 0g，加入適量去離子水，50 ℃水浴30 min，待溶液冷卻后定容至100 mL，再3 000r／min離心5 min，取 上清液1 mL 進(jìn)行DNS法檢測(cè)，根據(jù)葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線確定還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中：m1為酶解后的還原糖的質(zhì)量，g；m0為初始還原糖的質(zhì)量，g；m2為50 ℃烘干試樣的質(zhì)量，g；w為50 ℃烘干試樣的含水率，%。

1.3.6 總糖的測(cè)定

精確稱取原料試樣，經(jīng)過(guò)酸水解、堿中和后定容，離心，采用DNS法測(cè)定。

1.3.7 酵母菌數(shù)的測(cè)定

稱取10.00g發(fā)酵后飼料，加入50mL 去離子水浸泡2min，上清液定容至250mL，采用血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料主要成分

葡萄皮渣由于加工的方式不同，其化學(xué)組分含量也會(huì)有所差別。根據(jù)豬飼料的國(guó)家（行業(yè)）標(biāo)準(zhǔn)［10］，飼料配伍中必須兼顧碳水化合物、有機(jī)氮、粗纖維物質(zhì)等主要成分的比例，以及在飼料中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)［11］。試驗(yàn)用的葡萄皮渣來(lái)自冰葡萄酒的壓榨原料。測(cè)定的主要成分結(jié)果見(jiàn)表1。表中也給出了豆粕、玉米面以及麩皮等擬配合農(nóng)副產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果。

表1 原料營(yíng)養(yǎng)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.1 Nutritional components of raw materials %

由表1可見(jiàn)，葡萄皮渣中總氮含量較少，糖含量偏低，需采用其他農(nóng)副產(chǎn)品補(bǔ)充其不足部分。玉米面含糖量較高，豆粕含氮量最高，麩皮的含氮量和含糖量適中，都是很好的營(yíng)養(yǎng)源。

2.2 飼料配比

根據(jù)表1中原料的主要營(yíng)養(yǎng)成分以及各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)搭配的原則［11］，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)成3種飼料配合比例，見(jiàn)表2。

表2 幾種發(fā)酵物料的配合比例Tab.2 The proportion of several fermentation materials

配比的設(shè)計(jì)要考慮到盡可能多地利用葡萄皮渣，同時(shí)還要兼顧總氮等其他因素。由表2可知，雖然3 個(gè)配比中粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)最小值是13.15%，卻仍然達(dá)不到國(guó)家（行業(yè)）標(biāo)準(zhǔn)粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤11.77%（絕干）［10－11］的要求，因此需要復(fù)合酶降解一部分粗纖維以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 葡萄皮渣配合飼料的干燥溫度

制成的葡萄皮渣豬飼料需經(jīng)過(guò)干燥，然后粉碎并取樣檢測(cè)。為了減少干燥時(shí)被檢測(cè)組分的損失，同時(shí)保證取樣均勻一致，采取風(fēng)干方式。將發(fā)酵飼料在不同溫度下熱風(fēng)干燥12h，檢測(cè)其中還原糖的變化。試驗(yàn)從30～100℃，間隔10℃為一個(gè)梯度。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 溫度對(duì)飼料中還原糖的影響Fig.1 The influence of temperature on reducing sugar in feed

在30～50 ℃時(shí)，美拉德反應(yīng)速度緩慢，飼料中還原糖損失比較少；超過(guò)50℃則糖的損失明顯加快。所以本試驗(yàn)確定熱風(fēng)干燥條件為50 ℃、12h。此時(shí)水分已較低，可以方便地進(jìn)行粉碎、取樣。50 ℃熱風(fēng)干燥溫度也比較容易控制，具有能耗少、時(shí)間短、營(yíng)養(yǎng)成分保留完好的優(yōu)點(diǎn)，適宜在生產(chǎn)中應(yīng)用。

2.4 復(fù)合酶酶解工藝

影響復(fù)合酶水解的主要因素，包括底物配比、加酶量、作用溫度和時(shí)間等。在葡萄皮渣配合飼料的3種配比中，粗纖維含量各不相同，因而酶解的底物量也不同。纖維素酶和木聚糖酶的比例直接影響復(fù)合酶的酶解效率。最佳工藝條件采取正交試驗(yàn)法確定，選擇正交表L9（34）。根據(jù)表2和圖1的結(jié)果，因素水平表如表3所示。

按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案L9（34）進(jìn)行飼料（配比）中的粗纖維降解試驗(yàn)，分別檢測(cè)9組試驗(yàn)組合中的還原糖并計(jì)算得率，結(jié)果列于表4中。

將表4中極差分析結(jié)果最次要的因素B 作為空列，進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。因素A 影響較顯著，因素C和D 均為影響顯著。因素作用的主次作用順序是D＞C＞A，最優(yōu)水平組合為A2C3D3。復(fù)合酶的3種配比水平影響不大，因此考慮到復(fù)合酶的成本因素，因素B 選擇B1，則最優(yōu)組合為A2B1C3D3，即酶解最優(yōu)條件為：配比二——葡萄皮渣、豆粕、麩皮、玉米面質(zhì)量比為2∶2∶1∶2，纖維素酶加入3U／g原料，木聚糖酶加入5U／g原料，酶解溫度為50 ℃，時(shí)間72h。

表3 復(fù)合酶水解L9（34）正交試驗(yàn)的因素和水平Tab.3 Factors and levels of enzymatic hydrolysis L9（34）orthogonal test

表4 復(fù)合酶水解L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of enzymatic hydrolysis L9（34）orthogonal experiment

表5 復(fù)合酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab.5 Variance analysis of enzymatic hydrolysis orthogonal test result

由于最優(yōu)工藝條件組合沒(méi)有含在表4的9組試驗(yàn)中，需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果還原糖得率為4.70%，高于表4中最好的A1B3C3D3組合的結(jié)果。

2.5 發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的變化

通過(guò)酵母菌發(fā)酵可以進(jìn)一步軟化飼料，同時(shí)產(chǎn)生酒香和酯香氣味，提高飼料的適口性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。將3 種飼料配比（表2）分別經(jīng)過(guò)酶解以后，接種0.05%活性干酵母，從72h開(kāi)始發(fā)酵至168h，共計(jì)4d，發(fā)酵溫度為30 ℃。降糖曲線見(jiàn)圖2。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中還原糖的變化Fig.2 The change of reducing sugar in fermentation process

由圖2可見(jiàn)，在72h之前，發(fā)酵物中還原糖的生成基本上符合正交試驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果（表5）。0～24h階段產(chǎn)糖速率較快，說(shuō)明此時(shí)復(fù)合酶酶活是最高的；24～72h階段還原糖增速減緩。從72h開(kāi)始，在酵母菌發(fā)酵作用下，還原糖降至1%～2%。

2.6 發(fā)酵過(guò)程中酵母數(shù)量的變化

酵母菌發(fā)酵從72h 開(kāi)始。3 種飼料配比中酵母菌生長(zhǎng)過(guò)程曲線見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中酵母數(shù)量的變化Fig.3 The change of yeast count in fermentation process

由圖3可見(jiàn)，3組配比中的酵母數(shù)量在72～96h增長(zhǎng)很快，而后逐漸緩慢。組二和組三的酵母生長(zhǎng)比較旺盛，至168h時(shí)達(dá)到1.6×106個(gè)細(xì)胞，是發(fā)酵前的8倍左右，而組1中的酵母菌生長(zhǎng)緩慢。發(fā)酵后期，由于還原糖被消耗，產(chǎn)物不斷生成，酵母生長(zhǎng)速率降低。

2.7 發(fā)酵前后飼料中主要成分含量的變化

葡萄皮渣、豆粕、麩皮和玉米面按一定的比例配合，經(jīng)復(fù)合酶酶解和酵母菌發(fā)酵后，粗纖維含量明顯降低，酒味和酯味比較突出。表6為發(fā)酵前后配合飼料中總氮和粗纖維含量的變化數(shù)據(jù)。將較優(yōu)的第2組配比飼料制成后，經(jīng)過(guò)50 ℃熱風(fēng)干燥24h后測(cè)定總氮和粗纖維含量，結(jié)果見(jiàn)表6所示。

表6 飼料主要成分的變化Tab.6 The change of main components in feed

由表6可見(jiàn)，配比二在發(fā)酵前后總氮含量變化不大，一部分飼料的蛋白質(zhì)在酵母發(fā)酵過(guò)程中轉(zhuǎn)變成菌體蛋白，提高了飼料蛋白的品質(zhì)。發(fā)酵后粗纖維降低了4.83%，低于飼料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；消化能值根據(jù)化學(xué)成分和總能計(jì)算［12］為13.53 MJ／kg，略高于飼料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié) 論

葡萄皮渣配合飼料最適配合比例：葡萄皮渣、豆粕、麩皮、玉米面質(zhì)量比為2∶2∶1∶2。復(fù)合酶的最佳配比為：纖維素酶3 U／g，木聚糖酶5U／g，作用溫度為50 ℃，時(shí)間為72h。發(fā)酵后的飼料成品中總氮18.81%，粗纖維11.42%，消化能值13.53 MJ／kg，均達(dá)到了國(guó)標(biāo)（行業(yè)）妊娠豬飼料要求。

研究發(fā)現(xiàn)，葡萄皮渣含有少量的糖分，氮含量偏低。脫水可以提高氮的含量，但同時(shí)也會(huì)增加粗纖維的含量。將豆粕、麩皮、玉米面與葡萄皮渣配合可以彌補(bǔ)葡萄皮渣的不足，但是粗纖維含量稍高于飼料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［10］。以纖維素酶和木聚糖酶為主的復(fù)合酶可以降解飼料粗纖維。試驗(yàn)中，復(fù)合酶將葡萄皮渣占27.2%的配比二中的粗纖維降低了4.83%，使之符合飼料標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，最優(yōu)的酶解條件A2B1C3D3將還原糖得率提高至4.70%，為酵母菌生長(zhǎng)和發(fā)酵提供了良好條件。

發(fā)酵飼料經(jīng)過(guò)50℃熱風(fēng)干燥后，主要營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)基本無(wú)損失，產(chǎn)品中含有少量還原性糖，其中的酵母菌也是優(yōu)良的蛋白質(zhì)資源［13］，蛋白質(zhì)含量大為提高。干燥的葡萄皮渣飼料成品有酒香、酯香和原料香味，提高了飼料的適口性。

葡萄皮渣配合飼料較普通配合飼料節(jié)約了成本，增加了經(jīng)濟(jì)效益。飼料中還可加入乳酸菌［14］，有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，提升飼料的品質(zhì)。飼料中賴氨酸［15］的含量和磷、鈣［16］的含量也是影響飼料品質(zhì)的因素，有待于進(jìn)一步研究。

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