周霞

貴州省人民醫(yī)院急診科，貴州貴陽550000

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

周霞

貴州省人民醫(yī)院急診科，貴州貴陽550000

目的運(yùn)用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6），比較不同質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例及不同時(shí)刻轉(zhuǎn)染HSC后綠色熒光蛋白的表達(dá)，確定高表達(dá)陽性克隆G418篩選條件。方法將細(xì)胞按質(zhì)粒與脂質(zhì)體的不同比例分為四組：A組（2ug：3uL），B組（2ug：4uL），C組（2ug：5uL），D組（2ug：6uL）混合后轉(zhuǎn)染大鼠HSC，約24 h觀察轉(zhuǎn)染率，以最高轉(zhuǎn)染率的質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，轉(zhuǎn)染大鼠HSC，比較轉(zhuǎn)染后24、48、72 h的轉(zhuǎn)染率；用不同濃度G418進(jìn)行篩選，確定篩選最佳濃度，通過G418篩選建立高表達(dá)EGFP的HSC-T6陽性克隆。結(jié)果轉(zhuǎn)染24 h后，各組均有綠色熒光蛋白的表達(dá)，與A、B、D組比較，C組轉(zhuǎn)染率明顯增高（P＜0.05），質(zhì)粒與脂質(zhì)體以2ug：5uL轉(zhuǎn)染HSC后，隨時(shí)間延長，轉(zhuǎn)染后48 h轉(zhuǎn)染率最高（P＜0.05），72 h有所下降，G418篩選最佳濃度為400 ug/mL，經(jīng)篩選約21d后可陽性克隆，更換為正常培養(yǎng)液可繼續(xù)培養(yǎng)和傳代。結(jié)論Lipofectamine 2000可有效轉(zhuǎn)染HSC，經(jīng)G418篩選形成陽性克隆，為基因治療肝纖維化的研究提供依據(jù)。

脂質(zhì)體；大鼠；肝星狀細(xì)胞

重組質(zhì)粒作為研究基因功能的主要手段，目前正得到越來越廣泛的應(yīng)用。運(yùn)用基因轉(zhuǎn)染載體將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并可建立穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。脂質(zhì)體作為非病毒轉(zhuǎn)染載體，其介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染是通過脂質(zhì)體DNA復(fù)合物與細(xì)胞融合，將DNA導(dǎo)入細(xì)胞，具有高效、簡便、對(duì)細(xì)胞損傷小和容易重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)自2013年10月—2014年5月運(yùn)用陽離子脂質(zhì)體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC-T6，并篩選轉(zhuǎn)染陽性克隆，初步探索Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HSC-T6的條件及方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6、pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒由武漢協(xié)和醫(yī)院胃腸病實(shí)驗(yàn)室提供。感受態(tài)大腸桿菌DH-5ɑ購自武漢晶賽生物工程技術(shù)公司，小量質(zhì)粒提取試劑盒購自寧波中鼎公司，G418購自北京索萊寶生物科技有限公司，陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的提取pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5ɑ，擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，調(diào)整質(zhì)粒濃度為1ug/ul，過濾滅菌備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6在含15%胎牛血清（FCS）的DMEM液，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，將HSC-T6細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后，按質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例分為四組：A組（2ug：3ul），B組（2ug：4uL），C組（2ug：5uL），D組（2ug：6uL）。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取一試管加入pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒，用250uL Opti-MEM培養(yǎng)基混合稀釋，另取試管分別加入3uL，4uL，5uL及6uL Lipofectamine 2000，用250uL Opti-MEM培養(yǎng)基混合稀釋，室溫?zé)o菌條件下放置5 min，將質(zhì)粒分別與不同劑量Lipofectamine 2000混合后放置20 min，每孔加入量為500 uL混合液培養(yǎng)4 h，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后記數(shù)10個(gè)200倍視野下發(fā)綠色熒光的細(xì)胞及同視野光鏡下細(xì)胞數(shù)計(jì)算轉(zhuǎn)染率，確定質(zhì)粒與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的最佳比例，按質(zhì)粒與脂質(zhì)體最佳比例轉(zhuǎn)染HSC-T6，觀察轉(zhuǎn)染24、48、76 h轉(zhuǎn)染率，各組細(xì)胞設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 G418篩選將HSC-T6接種于24孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后，分別加入含100、150、200、250、300、350、400、500、700ug/mL，800ug/lG418培養(yǎng)基，15%FCS的DMEM培養(yǎng)液2ml，觀察15 d后細(xì)胞全部死亡的G418最低濃度，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.2.5 G418篩選陽性克隆將HSC-T6細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后，按細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，將pcDNA3.1 (+)-EGFP與Lipofectamine 2000按最佳比例轉(zhuǎn)染HSC，4h后改用含G418培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，篩選出陽性克隆后，更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)和傳代。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

記量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 17.0軟件處理，數(shù)據(jù)顯著性檢驗(yàn)用方差分析，并進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染率的觀察

將pcDNA3.1(+)-EGFP與Lipofectamine 2000以2ug：3uL，2ug：4uL，2ug：5uL及2ug：6uL轉(zhuǎn)染HSC-T6，24 h后均可見綠色熒光蛋白的表達(dá)，與A、B、D各組比較，C組轉(zhuǎn)染率明顯增高（P＜0.05見表1）。

表1 各組轉(zhuǎn)染率比較

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染率的觀察

將pcDNA3.1(+)-EGFP與Lipofectamine 2000以2ug：5uL轉(zhuǎn)染HSC-T6后，24 h即可見綠色熒光蛋白表達(dá)，48h綠色熒光蛋白表達(dá)最高，72 h則有所下降，48 h時(shí)轉(zhuǎn)染率較24 h明顯增高（29.22± 1.14 vs 19.47±4.16 P＜0.05），與72 h比較無明顯差異（29.22±1.14 vs 24.66±2.00 t=7.764，P=0.088）。

2.3 脂質(zhì)體Lipofectamin 2000對(duì)細(xì)胞的毒性作用和G418篩選

應(yīng)用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HSC-T6后鏡下觀察顯示，在5uL的用量下，HSC-T6細(xì)胞未見明顯細(xì)胞死亡表現(xiàn)。篩選結(jié)果顯示：當(dāng)細(xì)胞更換為含G418的培養(yǎng)基后，隨G418濃度升高，時(shí)間延長，各孔均可見細(xì)胞死亡，6 d后，500ug/mL濃度以上細(xì)胞全部死亡，篩選15 d后，細(xì)胞全部死亡最低濃度為300ug/mL。

2.4 陽性克隆的篩選

pcDNA3.1(+)-EGFP與Lipofectamine 2000比例為2u：5uL轉(zhuǎn)染HSC-T6 4 h，改用含400ug/mlG418培養(yǎng)基，15%FCS的DMEM培養(yǎng)液2 mL，6 d后細(xì)胞大部分死亡，G418濃度減至200ug/mL維持篩選，殘存細(xì)胞約14d后形成陽性克?。▓D1）。

圖1 篩選20 d后陽性

3 討論

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在生物學(xué)研究領(lǐng)域和臨床應(yīng)用都已取得了很大的進(jìn)展。目前使用的基因傳遞載體有病毒載體和非病毒載體兩類[1]。陽離子脂質(zhì)體作為非病毒載體，在基因轉(zhuǎn)染中得到廣泛應(yīng)用[2-3]。HSC作為肝纖維化發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)倍受關(guān)注，以HSC為靶標(biāo)的治療措施逐漸成為抗纖維化的重要方法[4]。較多實(shí)驗(yàn)通過基因轉(zhuǎn)染的方法，體外研究HSC激活機(jī)制或抗纖維化機(jī)制的研究，但其轉(zhuǎn)染條件及方法仍需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC，24 h后可見綠色熒光蛋白表達(dá)情況，說明Lipofectamine 2000可成功轉(zhuǎn)染HSC-T6。

國外研究已證實(shí)，脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染率除外與陽離子脂質(zhì)體的構(gòu)型有關(guān)外，還與陽離子脂質(zhì)體與DNA的比例，脂質(zhì)體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)體復(fù)合物的劑量等有關(guān)[5-6]。脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的大小和形狀受陽離子脂質(zhì)體和DNA的摩爾比影響，脂質(zhì)體與DNA的電荷比在1∶1時(shí)，則有明顯的大小及結(jié)構(gòu)的改變，形成的復(fù)合體的粒徑最大，在體內(nèi)的半衰期延長，基因轉(zhuǎn)染效率最高[7-8]。我們將質(zhì)粒與不同劑量脂質(zhì)體混合轉(zhuǎn)染HSC-T6，當(dāng)質(zhì)粒與Lipofectamine 2000比例為2ug：5uL時(shí)，轉(zhuǎn)染率最高，同時(shí)，觀察轉(zhuǎn)染24、48及72 h后綠色熒光蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間延長，轉(zhuǎn)染率有所增高，48 h轉(zhuǎn)染率最高，72 h后綠色熒光蛋白的表達(dá)有所下降。基于本研究，推測(cè)質(zhì)粒與Lipofectamine 2000比例為2ug：5uL時(shí)，脂質(zhì)體與DNA電荷比接近1：1，可獲得最佳轉(zhuǎn)染率，但隨著時(shí)間的延長至72 h，綠色熒光蛋白的表達(dá)會(huì)有所下降，目的基因不能得到穩(wěn)定的表達(dá)。

為了目的基因得到穩(wěn)定表達(dá)，可根據(jù)質(zhì)粒上帶有的耐藥基因而選擇相應(yīng)藥物進(jìn)行篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，目前最常用的方法是G418篩選。HSC-T6細(xì)胞系經(jīng)G418篩選15 d后，細(xì)胞全部死亡最低濃度為300ug/mL，確定篩選濃度為400ug/mL，維持篩選濃度為200ug/mL。將pcDNA3.1(+)-EGFP與Lipofectamin 2000比例為2u：5uL轉(zhuǎn)染HSC-T6 4 h后，通過G418篩選，約20 d后可形成陽性克隆，并可正常培養(yǎng)和傳代。

本研究證實(shí)：Lipofectamine 2000可高效轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6，當(dāng)質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例為2ug：5uL可獲得最高轉(zhuǎn)染率，G418篩選可獲得基因穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆，本實(shí)驗(yàn)為運(yùn)用該細(xì)胞系進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染方面的研究，尤其是運(yùn)用穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞系開展肝臟疾病，特別是肝纖維化方面的研究奠定基礎(chǔ)。

[1]Weiwei Wang,Wenzhong Li,Nan Ma,et al.Non-Viral Gene DeliveryMethods[J].Current Pharmaceutical Biotechnology,2013（14）:46-60.

[2]Kai K Ewert,Alexandra Zidovska,Ayesha Ahmad,et al.Cationic Liposome-Nucleic Acid Complexes for Gene Delivery and Silencing:Pathways and Mechanisms for Plasmid DNA and siRNA[J].Top Curr Chem，2010,296: 191-226.

[3]Caracciolo G,Amenitsch H.Cationic liposome.DNA complexes:from structure to interactions with cellular menmbranes[J].Eur Biophys J,2012,41(10): 815-829.

[4]Kang JH,Toita R,Murata M.Liver cell-targeted delivery of therapeutic molecules[J].Crit Rev Biotechnol,2014（15）:1-12.

[5]Chen JL,Wang H,Gao JQ,et al.Liposomes modified with polycation used for gene delivery:preparation,characterization and transfection in vitro[J].Int J Pharm,2007,343(1-2):255-261.

[6]Obata Y,Ciofani G,Raffa V,et al.Evaluation of cationic liposomes composed of an amino acid-based lipid for neuronal transfection[J]. Nanomedicine,2010,6(1):70-77.

[7]Majeti BK,Karmali PP,Reddy BS,et al.In vitro gene transfer efficacies of N,N-dialkylpyrrolidinium chlorides:a structure-activity investigation[J].J Med Chem,2005,48(11):3784-3795.

[8]Yang Y,Zhang Z,Chen L,et al.Effect of multifold charge groups and imidazole-4-carboxadehyde on physicochemical characteristics and transfection of cationic polyphosphazenes/DNA complexes[J].Int J Pharm, 2010,390(2):191-197.

R78

A

1672-5654（2014）10（c）-0180-02

2014-08-13）

周霞（1982-），女，漢族，貴州遵義人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)科臨床工作。