臧玉紅，李仁杰

（1.承德石油高等?？茖W(xué)校化工系，河北承德067000；2.中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京211196）

食用菌多糖是食用菌最重要的功能性物質(zhì)之一，具有多方面的生物活性，如抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗?jié)?、抗衰老、抗輻射等生理功能。且對防止軟骨病、預(yù)防感冒、降低血清膽固醇、增強(qiáng)免疫等也有良好的效果[1-4]。因此，近年來對提取食用菌多糖的研究越來越引起人們的關(guān)注。但要想對多糖的組成、結(jié)構(gòu)和功能等進(jìn)行更深入的研究，還需對粗多糖進(jìn)行純化，在多糖雜質(zhì)中，影響最大、最難除去的雜質(zhì)就是蛋白質(zhì)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)不僅能與多糖形成復(fù)合物，增加對多糖的吸附性，而且蛋白質(zhì)還具有熱源性，影響多糖的分離，所以脫除蛋白質(zhì)是純化多糖的關(guān)鍵[5]。

目前，常用于脫除蛋白質(zhì)的方法主要有：Sevag法、氯化鈉法、殼聚糖絮凝法、三氯乙酸法（TCA）[5]、鹽酸法、三氟三氯乙烷法、蛋白酶法[6]、超濾法[7]、大孔樹脂法[8]等。經(jīng)研究，每種脫除蛋白的方法各具特點(diǎn)[9-10]，徐韌博等[5]對三氯乙酸法純化多糖有一定的研究，但目前采用響應(yīng)面法，對多糖的保留率及蛋白質(zhì)的脫除率進(jìn)行雙響應(yīng)值分析，純化滑子菇多糖的優(yōu)化工藝還未見報道，本實(shí)驗(yàn)采用三氯乙酸法，選擇多糖溶液與三氯乙酸的比例（料液比）、脫除時間、三氯乙酸濃度等作為考察因素，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的Box-Behnken確定多糖純化條件，以蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率作為評價指標(biāo)，利用響應(yīng)面擬和所得方程對滑子菇多糖純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率的最佳工藝，為滑子菇粗多糖的進(jìn)一步純化提供了科學(xué)依據(jù)，并且為合理地開發(fā)和利用滑子菇資源奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

滑子菇 市場采購；鹽酸、氫氧化鈉、正丁醇、95%乙醇、三氯甲烷、蒽酮、硫酸、葡萄糖、丙酮、三氯乙酸、苯酚等 均為分析純；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白 為生化試劑。

101-2型干燥箱 鄭州市萬博儀器設(shè)備有限公司；組織搗碎機(jī) 上海比朗儀器有限公司；80-2B型離心機(jī) 上海安寧科學(xué)儀器廠；HH-6型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；SHB-B型真空抽濾機(jī) 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KDM型電熱套 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；721型及722型分光光度計 上海第三分析儀器廠；JY3002型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 三氯乙酸法脫除滑子菇多糖蛋白質(zhì)的工藝流程圖 滑子菇→粉碎→過篩→（脫脂）→稱重→熱水浸提→抽濾→濾液濃縮→醇沉→洗滌→烘干→粗多糖→加入TCA→靜置→醇沉→離心→冷凍干燥→脫蛋白質(zhì)多糖。

1.2.2 多糖含量的測定 苯酚-硫酸法[11-12]。標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液用苯酚-硫酸試劑處理后，在490nm處測吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測定待測樣品溶液的吸光度，根據(jù)回歸方程計算出相應(yīng)的濃度，從而求出多糖的含量。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)法[5-6，13]。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，在595nm處測吸光值，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 計算方法

1.2.4.1 多糖保留率 計算公式為：

其中：Y1—多糖保留率（%）；A0—為初始樣品中多糖的含量；A1—為脫除蛋白后樣品中多糖的含量。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)脫除率計算[14]計算公式為：

其中：Y2—蛋白質(zhì)脫除率；C0—為初始樣品中蛋白質(zhì)的含量；C1—為除蛋白處理后樣品中蛋白質(zhì)的含量。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 多糖溶液與三氯乙酸的比例（料液比） 將10mg/m L滑子菇粗多糖溶液與10%的三氯乙酸試劑分別于3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的體積比混合，靜置60m in后，醇沉、3500r/m in離心10m in，分別測定蛋白質(zhì)及多糖的含量，確定料液比對蛋白脫除率及多糖保留率的影響。

1.2.5.2 三氯乙酸濃度的選擇 將滑子菇多糖提取液分別與1%、3%、5%、7%、9%、12%、15%（W/W）的TCA，充分搖勻后，靜置60m in后，醇沉、3500r/m in離心10min，分別測定多糖和蛋白質(zhì)的含量，確定三氯乙酸濃度對脫蛋白率及多糖保留率的影響。

1.2.5.3 脫除時間 將滑子菇多糖提取液與10%的TCA按1∶2混合后分別靜置10、30、50、70、90、120、150min，醇沉、3500r/min離心10min，分別測定多糖和蛋白質(zhì)的含量，確定作用時間對脫蛋白率及多糖保留率的影響。

1.2.6 響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用中心組合實(shí)驗(yàn)Box-Behnken進(jìn)行方案設(shè)計[15-19]，優(yōu)化脫蛋白工藝。選擇料液比，脫蛋白時間，三氯乙酸濃度三個因素為自變量，分別以X1、X2、X3表示，并以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平進(jìn)行編碼，以蛋白質(zhì)脫除率、多糖損失率為響應(yīng)值，因素編碼及水平見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計因素水平及編碼Table1 Factors and coded levels in the Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖含量測定和蛋白質(zhì)含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

圖2 蛋白質(zhì)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of protein

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法，得到多糖含量與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。蛋白質(zhì)含量與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

2.2 TCA法脫除蛋白單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 滑子菇多糖提取液與三氯乙酸比例（料液比）對蛋白質(zhì)脫除率及多糖保留率的影響 結(jié)果如圖3所示。通過圖3分析可知，料液比對蛋白質(zhì)的脫除率和多糖的保留率都有比較明顯的影響，其中蛋白質(zhì)的脫除率隨著料液比的升高呈現(xiàn)上升趨勢，而糖的保留率則呈下降趨勢，料液比1∶1后，脫除蛋白的能力緩慢增加，但多糖損失率則明顯下降，綜合考慮，多糖樣品與TCA的比值在1∶2附近較好。

圖3 料液比對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響Fig.3 Effectof solid-liquid ratio on the removal protein yield and polysaccharide

2.2.2 三氯乙酸濃度對蛋白質(zhì)脫除率及多糖保留率的影響 結(jié)果如圖4所示。通過分析可知，TCA濃度變化對脫除蛋白質(zhì)及多糖的保留值都有顯著的影響，增加TCA用量可以明顯提高蛋白質(zhì)的脫除率，但多糖損失率也在顯著增加。當(dāng)TCA用量7%以上時，隨TCA濃度繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)脫除率增加緩慢，而多糖保留率則大幅度下降，從蛋白質(zhì)的脫除率及多糖保留率兩方面綜合考慮，6%的TCA濃度能對滑子菇多糖中蛋白質(zhì)的脫除有較好的效果，且多糖保留率較高。

圖4 TCA濃度對蛋白質(zhì)脫除率及多糖保留率的影響Fig.4 Effectof concentration of TCA on the removal protein yield and polysaccharide retention yield

2.2.3 作用時間對蛋白質(zhì)脫除率及多糖保留率的影響 結(jié)果如圖5所示。由圖5分析可知，TCA與多糖提取液混合后靜置時間對多糖和蛋白質(zhì)都有影響，開始時，隨著靜置時間的延長，蛋白質(zhì)的脫除效果明顯增大，60m in后，蛋白質(zhì)脫除趨于平穩(wěn)，而多糖的保留率則繼續(xù)下降，綜合考慮，60m in是最佳處理時間。

圖5 TCA作用時間對蛋白質(zhì)脫除率及多糖保留率的影響Fig.5 Effect of TCA role of times on the removal protein yield and polysaccharide retention yield

2.3 響應(yīng)曲面的設(shè)計實(shí)驗(yàn)

按照表1的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計方案進(jìn)行3因素與3水平實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

Table2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table2 Box-Behnken experimental designmatrix and experimental results

2.4 回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

利用Design Expert 8.05b軟件對表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得多糖保留率（Y1）和蛋白質(zhì)脫除率（Y2）對自變量料液比（X1）、脫除時間（X2）、TCA濃度（X3）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

多糖保留率（Y1）和蛋白質(zhì)脫除率（Y2）的回歸方程方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果分別見表3和表4所示。

通過表3分析可知，該模型中各因素對滑子菇多糖保留率影響的程度分別為：X1、X2、X3、X影響高度顯著；X、X影響極顯著；X1X2、X2X3影響顯著；而只有X1X3影響不顯著。所考察因素的顯著性排序?yàn)椋篨2、X1、X3，即：作用時間、樣液與TCA的比值、TCA濃度。

表3 多糖保留率（Y1）回歸方程模型方差分析及方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table3 Analysis of variance and significance test for each of the fitted regression equationmodel of the polysaccharide retention yield（Y1）

表4 蛋白質(zhì)脫除率（Y2）回歸方程模型方差分析及方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table4 Analysisofvariance and significance test foreach of the fitted regression equationmodel of the removal protein yield（Y2）

由表4分析可知，該模型中各因素對脫除蛋白質(zhì)影響的程度分別為：X1、X3、X影響高度顯著；X2、X1X3、X、X影響極顯著；X1X2影響顯著；而只有X2X3影響不顯著。所考察因素的顯著性排序?yàn)椋篨1、X3、X2，即：樣液與TCA的比值、TCA濃度、作用時間。

由表3、表4綜合分析可知，Y1、Y2回歸模型的R2分別為0.9910、0.9880，R分別為0.9795、0.9727，說明該模型的擬合度非常好，p值均＜0.0001，表明此模型是高度顯著的，可以采用回歸模型對響應(yīng)值多糖的保留率（Y1）和蛋白質(zhì)的脫除率（Y2）進(jìn)行預(yù)測，說明該模型是有意義的。該模型失擬項(xiàng)的p值分別為0.0560、0.0819（p＞0.05），說明其影響不顯著，即失擬項(xiàng)與純誤差沒有顯著差異，則說明實(shí)驗(yàn)操作可信，可以用回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.5 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程，作響應(yīng)曲面圖，考察所擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析各影響因素對多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率的影響以及各因素間的交互效應(yīng)，如圖6（a～f）所示。各圖顯示作用時間、料液比、TCA濃度中任意兩個變量編碼為零水平時，其余兩個變量對多糖保留率的影響（圖6a～c）和對蛋白質(zhì)脫除率的影響（圖6d～f）。

從圖6（a～f）中可以看出，當(dāng)三個因素中任意一個因素取中間值，其余兩個因素同時變化時，隨著二者的增加，多糖保留率Y1均呈現(xiàn)比較明顯的下降趨勢，而蛋白質(zhì)脫除率Y2則呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。其中，圖6（e）的曲面最陡峭，表明TCA濃度和料液比之間對蛋白質(zhì)脫除率交互性最強(qiáng)，圖6（a）、圖6（c）、圖6（d）曲面較陡峭，而圖6（b）、圖6（f）曲面坡度較為緩慢，表明脫除時間和料液比之間對多糖保留率、蛋白質(zhì)脫除率均有較強(qiáng)的交互作用，脫除時間和TCA濃度對多糖保留率有較強(qiáng)的交互作用，這與方差分析的結(jié)果相一致。

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)結(jié)果和回歸方程，利用Design Expert 8.05b軟件處理所得數(shù)據(jù)，從中可以獲得一組最佳工藝參數(shù)：料液比1∶2.76，作用時間51.96m in，TCA濃度5.78%，在此條件下，多糖保留率預(yù)測值為75.40%，蛋白質(zhì)脫除率為84.39%。根據(jù)實(shí)際情況，確定料液1∶3，作用時間50min，TCA濃度6%，實(shí)際測得多糖保留率為75.08%，蛋白質(zhì)脫除率為84.16%，與預(yù)測值接近，可見該模型對滑子菇多糖保留效果和蛋白質(zhì)的脫除效果能進(jìn)行較好的預(yù)測。

3 結(jié)論

3.1 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對主要影響因素進(jìn)行中心組合設(shè)計實(shí)驗(yàn)，并利用Design Expert 8.05b軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，通過方差分析，得到該模型中各因素對滑子菇多糖保留率影響的顯著性排序?yàn)椋篨2、X1、X3，即：作用時間、樣液與TCA的比值、TCA濃度。對蛋白質(zhì)脫除率影響顯著性排序?yàn)椋篨1、X3、X2，即：樣液與TCA的比值、TCA濃度、作用時間。

圖6 各因素交互作用對多糖保留率（a～c）和蛋白質(zhì)脫除率（d～f）的影響Fig.6 The effectof experimental factors interaction on the polysaccharide retention yield（a～c）and the removal protein yield（d～f）

3.2 根據(jù)回歸方程對多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率兩個方面進(jìn)行考核，得到三氯乙酸法純化滑子菇多糖的最佳工藝參數(shù)為：多糖提取液與TCA體積比為1∶3，脫除時間為50min，TCA濃度為6%，在此條件下多糖保留率為75.08%，蛋白質(zhì)脫除率為84.16%，與預(yù)測值接近，可見該模型對滑子菇多糖保留效果和蛋白質(zhì)的脫除效果能進(jìn)行較好的預(yù)測。

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