文- 孫育杰

今年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)三位獲獎(jiǎng)人，打破了光學(xué)成像中長(zhǎng)期存在的衍射極限，將熒光顯微成像的分辨率帶入“納米時(shí)代”，為生命科學(xué)研究帶來(lái)巨大變化

10月8日，2014 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了美國(guó)科學(xué)家埃里克·白茲格（Eric Betzig）、威廉姆·莫納（William Moerner）和德國(guó)科學(xué)家施泰方·海爾（Stefan Hell），以表彰他們?cè)诔叻直媛薀晒怙@微技術(shù)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)。正如官方頒獎(jiǎng)文中描述，這類技術(shù)從方法實(shí)現(xiàn)到在科學(xué)研究中大展身手雖然不過(guò)十幾年時(shí)間，但已對(duì)多個(gè)領(lǐng)域產(chǎn)生顯著推動(dòng)，并且可以預(yù)言在未來(lái)將給生命科學(xué)研究帶來(lái)巨大的變化。

諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)評(píng)選委員會(huì)在當(dāng)天的聲明中說(shuō)，長(zhǎng)期以來(lái)，光學(xué)顯微鏡的分辨率被認(rèn)為不會(huì)超過(guò)光波波長(zhǎng)的一半，這被稱為“阿貝分辨率”。借助熒光分子的幫助，今年獲獎(jiǎng)?wù)邆兊难芯砍晒擅畹乩@過(guò)了經(jīng)典光學(xué)的這一“束縛”，他們開(kāi)創(chuàng)性的成就使光學(xué)顯微鏡能夠窺探納米世界。如今，納米級(jí)分辨率的顯微鏡在世界范圍內(nèi)廣泛運(yùn)用，人類每天都能從其帶來(lái)的新知識(shí)中獲益。

諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)評(píng)選委員會(huì)還指出，得獎(jiǎng)?wù)叩难芯吭试S人類觀察病毒以至細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，對(duì)了解有關(guān)物質(zhì)的功能作出重大貢獻(xiàn)，例如可用于觀察帕金森癥、腦退化癥和亨廷頓病患者體內(nèi)的蛋白變化等。

埃里克·貝齊格

斯特凡·黑爾

威廉·莫納

打破衍射極限

我們?nèi)搜垡话阕钚∧芸匆?jiàn)大約0.1毫米的東西，而生物的基本單元——細(xì)胞的直徑平均約為20微米或0.02毫米，所以對(duì)生物微觀世界的觀察需要使用光學(xué)顯微鏡。光學(xué)顯微技術(shù)有很多優(yōu)點(diǎn)，不但能放大微觀世界，同時(shí)還對(duì)樣品沒(méi)有損害，并且可以特異地觀察目標(biāo)對(duì)象。這種特異性一般是通過(guò)熒光顯微技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。熒光是物質(zhì)吸收光照后發(fā)出的光，一般發(fā)射光波長(zhǎng)比吸收光波長(zhǎng)更長(zhǎng)，因此可以單獨(dú)檢測(cè)熒光，對(duì)目標(biāo)實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測(cè)。

然而，光學(xué)顯微鏡的分辨率是有限的。由于光的衍射，即使一個(gè)無(wú)限小的光點(diǎn)在通過(guò)透鏡成像時(shí)也會(huì)形成一個(gè)彌散圖案，俗稱“艾里斑”。這樣即便兩個(gè)物點(diǎn)相距較遠(yuǎn)，其彌散斑卻可能很近，以致無(wú)法區(qū)分。

基于此原理，早在1873年，德國(guó)科學(xué)家恩斯特阿貝（ErnstAbbe）提出阿貝光學(xué)衍射極限，并作為重要成就刻于其墓碑上。根據(jù)這一極限，光學(xué)顯微鏡的分辨率約為檢測(cè)光波長(zhǎng)的一半，300納米左右（可見(jiàn)光的波長(zhǎng)為400～700納米），或是我們頭發(fā)直徑的1/300。超高分辨率熒光顯微技術(shù)通過(guò)一系列物理原理和化學(xué)機(jī)制“打破”了這一衍射極限，把光學(xué)顯微鏡的分辨率提高了幾十倍，使我們以前所未有的視角觀察生物微觀世界。

探測(cè)微觀世界

發(fā)展超高分辨率熒光顯微技術(shù)，對(duì)生物學(xué)研究意義非常重大。

目前的超高分辨率熒光顯微技術(shù)大體分為三類：受激發(fā)射損耗、結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)和單分子技術(shù)。其歷史可以追溯到上個(gè)世紀(jì)80年代。這次獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的三位科學(xué)家是這個(gè)方向的先驅(qū)人物。

1994年，此次獲獎(jiǎng)的德國(guó)科學(xué)家施泰方·海爾當(dāng)時(shí)還是博士后，他最先提出用受激發(fā)射損耗的方法（簡(jiǎn)稱STED）打破光學(xué)衍射極限，并最終在2000年的實(shí)驗(yàn)中得以實(shí)現(xiàn)。

STED方法利用了類似于產(chǎn)生激光的受激輻射原理，將一束形似于面包圈的激光光斑套在用于激發(fā)熒光的激光光斑外，這個(gè)面包圈激光可以抑制其區(qū)域內(nèi)熒光分子發(fā)出熒光，這樣通過(guò)不斷縮小面包圈的孔徑就可以獲得一個(gè)小于衍射極限的熒光發(fā)光點(diǎn)，并通過(guò)掃描實(shí)現(xiàn)超高分辨率的圖像，將光學(xué)顯微鏡分辨率提高了近10倍。

施泰方·海爾現(xiàn)為德國(guó)哥根廷大學(xué)教授和德國(guó)馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所所長(zhǎng)。從2000年開(kāi)始，他不斷改進(jìn)STED技術(shù)，使其更加適用于生物研究。另外，他還通過(guò)相似原理發(fā)明了一系列的超高分辨率技術(shù)，統(tǒng)稱為可逆飽和熒光躍遷（RESOLFT），為超分辨率熒光顯微成像技術(shù)的發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。

基于結(jié)構(gòu)照明原理的超高分辨率技術(shù)是美國(guó)科學(xué)家麥茨·古塔弗森（MatsGustafsson）在2000年發(fā)明的，非常適于細(xì)胞研究，可惜分辨率只提高了一倍。這個(gè)技術(shù)基于兩個(gè)高空間頻率的圖案重疊可以形成低頻率莫爾條紋的原理，通過(guò)解析莫爾條紋實(shí)現(xiàn)超高分辨率成像。可惜古塔弗森于2011年51歲時(shí)因癌癥去世，英年早逝，無(wú)緣分享這次的諾貝爾獎(jiǎng)。

超分辨熒光顯微鏡技術(shù)真正成熟并得以在生物研究中廣泛應(yīng)用，是2006年同時(shí)出現(xiàn)的兩種基于隨機(jī)重構(gòu)原理的超高分辨率光學(xué)成像技術(shù)。當(dāng)時(shí)是由哈佛大學(xué)莊小威教授（隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)STORM技術(shù)）、埃里克·貝齊格（光活化定位顯微術(shù)PALM技術(shù)）及薩繆爾·海斯（SamuelHess，熒光活化定位顯微術(shù)fPALM技術(shù)）三個(gè)研究組分別同時(shí)獨(dú)立發(fā)明的。它們的原理非常像，都是基于熒光分子的光轉(zhuǎn)化能力和單分子定位，通過(guò)用光控制每次僅有少量隨機(jī)離散的單個(gè)熒光分子發(fā)光，并準(zhǔn)確定位單個(gè)熒光分子艾里光斑的中心，把多張圖片疊加形成一幅超高分辨率圖像。

STED顯微技術(shù)的原理

這種“以時(shí)間換空間”的思路非常巧妙，把熒光成像的分辨率一下子提高了20倍左右。

這次獲獎(jiǎng)的威廉·莫納現(xiàn)為美國(guó)斯坦福大學(xué)講座教授，是單分子熒光技術(shù)的先驅(qū)人物。1989年，他任職于美國(guó)IBM研究中心時(shí)在世界上首次實(shí)現(xiàn)了單個(gè)分子的光吸收的測(cè)量。1997年，他與因?yàn)榫G色熒光蛋白獲得2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的錢永健合作發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白的光轉(zhuǎn)化效應(yīng)。

而埃里克·白茲格是美國(guó)霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的教授，是熒光顯微技術(shù)領(lǐng)域的領(lǐng)軍人物。他最早在1992年就實(shí)現(xiàn)了近場(chǎng)超高分辨率熒光成像，其后在1994年提出了基于單分子信號(hào)實(shí)現(xiàn)超高分辨率成像的思想，并于2006年在實(shí)驗(yàn)中得以實(shí)現(xiàn)。

值得指出的是莊小威教授作為STORM超分辨技術(shù)的發(fā)明人，其研究團(tuán)隊(duì)一直領(lǐng)導(dǎo)并推進(jìn)著超高分辨率顯微技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，是近8年來(lái)這個(gè)領(lǐng)域最活躍的研究團(tuán)隊(duì)。

超高分辨率成像作為一類很新的技術(shù)，突破了光學(xué)成像中的衍射極限，把傳統(tǒng)成像分辨率提高了10～20倍，好比一個(gè)近視眼的人突然戴上了合適的眼鏡，這一技術(shù)因此成為研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)的利器。

過(guò)去七八年間，超高分辨率成像技術(shù)不斷推進(jìn)，先后實(shí)現(xiàn)了多色、三維和活細(xì)胞高速成像。其生物應(yīng)用也很廣泛，包括細(xì)胞膜蛋白分布、細(xì)胞骨架、線粒體、染色質(zhì)和神經(jīng)元突觸等。超高分辨率技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)就引起廣泛關(guān)注，先是在2006年被世界著名《科學(xué)》期刊評(píng)為年度十大技術(shù)突破，接著被生物醫(yī)學(xué)方法學(xué)最好的期刊《自然-方法》評(píng)為2008年度方法。在近期《自然-方法》十周年特刊評(píng)出的10年10大技術(shù)中，超高分辨率成像和單分子技術(shù)也都位列榜中。

跨界諾貝爾獎(jiǎng)

就像利用哈勃天文望遠(yuǎn)鏡認(rèn)識(shí)宇宙，人類對(duì)微觀世界的了解極大地依賴于光學(xué)顯微技術(shù)。今年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)三位獲獎(jiǎng)人打破了光學(xué)成像中長(zhǎng)期存在的衍射極限，將熒光顯微成像的分辨率帶入到“納米時(shí)代”，讓我們能更精確地窺探微觀世界，這將為疾病研究和藥物研發(fā)帶來(lái)革命性的變化，也將為世界上方興未艾的腦計(jì)劃提供關(guān)鍵支持。

有趣的是，這次的三位諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主都是物理學(xué)博士，而這次獲獎(jiǎng)的成果也是典型的跨界研究，結(jié)合物理思想、光學(xué)技術(shù)和化學(xué)探針，為生物學(xué)研究提供了前所未有的強(qiáng)大工具，是一個(gè)典型的技術(shù)諾貝爾獎(jiǎng)。

事實(shí)上，生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域大量的懸疑正持續(xù)吸引具有不同背景的專業(yè)人才加入到研究隊(duì)伍中來(lái)，這種交叉融合的方式將會(huì)大大促進(jìn)生物醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步。毋庸置疑，未來(lái)我們還將看到更多像這樣的跨界諾貝爾獎(jiǎng)！

常規(guī)的共聚焦顯微鏡（左）與STED顯微鏡（右）效果對(duì)比圖