李政龍，申 奧，欒維江

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

同源異型盒（homeobox，HB）是同源異型基因中都具有的保守基序，廣泛存在于動物、植物和微生物中.該序列出現(xiàn)在真核生物進化的早期，在生物發(fā)育中具有重要功能[1].由同源異型盒編碼的蛋白序列稱為同源異型結(jié)構(gòu)域（homeodomain，HD）.植物HB轉(zhuǎn)錄因子家族可分為6類：HD-Zip（homeodomain-leucinezipper）、KNOX （knotted-like homeobox）、PHD-Finger（plant homeodomain-finger）、BELL（bell homeodomain）、WOX（Wuschel-related homeobox）和 ZF-HD（zinc fingerhomeodomain）[2].其中，HD-Zip由DNA同源異型結(jié)構(gòu)域和附加的leucine-zipper（亮氨酸拉鏈）元件組成[3]，主要參與調(diào)控植物正常生長以及環(huán)境脅迫后植物的生長發(fā)育[4].根據(jù)結(jié)構(gòu)域的保守性、序列結(jié)構(gòu)以及生理學(xué)功能，HD-Zip家族又可以分為HD-ZipⅠ、HD-ZipⅡ、HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ等4個亞家族[4].HD-ZipⅢ基因是近年來研究較多的一類，在植物胚胎及胚后形態(tài)發(fā)生（頂端分生組織及側(cè)生分生組織的形成）、側(cè)生器官的極性建立和維管組織細胞分化為葉片的功能等方面具有重要作用[5-6].如擬南芥中HD-ZipⅢ基因家族包括 AtHB8、AVB1（REV）/IFL1//REVOL UTA、AtHB15/CORONA（CAN）、AtHB9（PHV）/PHAVO-LUTA和AtHB14（PHB）等5個成員，它們在調(diào)控頂端分生組織的分化、側(cè)部器官的極性和次生維管的發(fā)育中發(fā)揮重要作用[2].水稻中HD-ZipⅢ也有5個成員，HDZ1和HDZ2是其中的2個基因.

植物蛋白質(zhì)的亞細胞定位是系統(tǒng)理解植物形態(tài)建成、生長發(fā)育和逆境耐性等必不可少的環(huán)節(jié)，也是功能基因組學(xué)的重要內(nèi)容[7].綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是細胞生物學(xué)研究領(lǐng)域廣泛使用的一種報告因子，該因子能在藍光或紫光的激發(fā)下產(chǎn)生綠色熒光[8]，具有檢測方便、高效、無需輔助因子和底物、對宿主細胞無傷害等優(yōu)點[9]，常用于活細胞中蛋白的鑒定、跟蹤和分析.1994年Chalfie等[10]首次用GFP作為報告蛋白，之后，GFP作為報告蛋白在多種植物、動物和微生物中均能夠成功表達，并逐漸發(fā)展為一項成熟的技術(shù)[11].

本課題組構(gòu)建了HDZ1和HDZ2轉(zhuǎn)錄因子的GFP融合表達載體，并分析其亞細胞定位，初步研究這2個轉(zhuǎn)錄因子在水稻中的功能和作用.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

水稻品種花11及煙草種植于天津師范大學(xué)人工氣候箱.農(nóng)桿菌菌株EHA105、pCAMBIA35S-GFP質(zhì)粒由本實驗室保存.

1.2 表達載體的構(gòu)建

從生長約15d的水稻幼苗中提取RNA.利用RTPCR擴增HDZ1和HDZ2基因編碼區(qū)（去除終止密碼子序列）. 所用 HDZ1的引物為 F：5′-TCAgagctc-ATTTGGCTTTGGCGAGGTAG-3′；R：5′-TACgtcgac-CACAAAGGACCAGTTGACGA-3′.HDZ2的引物為 F：5′-ATAgagctcGAGAAGAAGGAGAAGGGTCG-3′；R ：5′-CTGtctagaGACGAATGACCAGTTGACGA-3′.反應(yīng)條件為：95℃，3 min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，2.5min，運行32個循環(huán)；72℃，5min.回收目的片段.用相應(yīng)的酶切位點（HDZ1為samI和sacI，HDZ2為sacI和salI）與空載體pCAMBIA35S-GFP連接獲得融合表達載體.

1.3 電激轉(zhuǎn)化

將感受態(tài)細胞取出解凍，向感受態(tài)細胞中加入1～3 μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，加入電擊杯中，冰上冷卻2～3 min.將電擊杯置于電擊儀中1800V電擊后，取出電擊杯中的混合液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入LB培養(yǎng)液培養(yǎng)至1個月，28℃搖床（220r/min）活化 3 min.取200μL涂布LB平板（含50mg/L的卡那霉素或50mg/L的利福平），28℃培養(yǎng)2～3 d.

1.4 GFP融合載體的瞬時表達

挑取含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，單克隆于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d.待菌液濃度達到OD值為0.5時，取2mL菌液加入離心管中，12000r/min離心1min，去上清液，重復(fù)加入2mL菌液，12000r/min離心1min，去上清液.加入2mL注射液（1mol/L的MgCl2、1mol/L的MES和0.2mol/L的AS），充分振蕩混勻.將混合液在室溫下靜置4h，之后進行煙草葉片轉(zhuǎn)化，3～4d后取煙草葉片表皮觀察GFP瞬時表達.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的同源比較

HDZ1和HDZ2是水稻HD-ZipⅢ家族成員，分別編碼1個由839和862個氨基酸組成的蛋白質(zhì).HDZipⅢ蛋白含有4個結(jié)構(gòu)域，從N端到C端依次是同源異型結(jié)構(gòu)域（HD）、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（ZIP）、START結(jié)構(gòu)域（START）和MEKHLA結(jié)構(gòu)域，如圖1（a）所示.其中，HD和ZIP結(jié)構(gòu)域在植物中有較高保守性.通過對HDZ1和HDZ2蛋白的HD和ZIP序列比較，發(fā)現(xiàn)二者在HD結(jié)構(gòu)的約60個保守氨基酸序列中，只有 7處不同，分別為第 18、19、24、26、32、39、57號殘基，如圖 1（b）所示.

圖1 HDZ1和HDZ2蛋白的結(jié)構(gòu)域及同源性比較Fig.1 Homeodomain and comparison of HDZ1and HDZ2

2.2 GFP融合載體的構(gòu)建及其酶切檢測

按照水稻數(shù)據(jù)庫中全長cDNA序列，設(shè)計帶有與載體中酶切位點對應(yīng)的特異性引物，用RT-PCR方法擴增目的基因的ORF（去除終止密碼子序列）.由于該轉(zhuǎn)錄因子家族在植物頂端分生組織中有較高的表達[22]，因此收集發(fā)芽后15d的水稻幼苗，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA模板進行PCR反應(yīng).HDZ1和HDZ2的ORF長度分別為2520bp和2589bp.為了驗證獲得的目的基因在PCR過程中是否有堿基突變，對獲得的條帶進行回收純化，電泳結(jié)果如圖2a所示，再進行下一步的酶切和連接.

圖2 目的基因和重組質(zhì)粒的電泳圖Fig.2 Electropherogram of target genes and recombinant plasmids

連接轉(zhuǎn)化后挑取單克隆進行酶切鑒定，重組質(zhì)粒都切出了預(yù)期的約2.5kb的片段，如圖2b所示，進行測序.與數(shù)據(jù)庫中的序列（HDZ1的基因號為LOC_Os03g01890，HDZ2為 LOC_Os03g43930）進行比對和確認，表明目的基因成功連接到載體中，可以進行下一步的亞細胞定位.

2.3 HDZ1和HDZ2亞細胞定位

重組質(zhì)粒（pCAMBIA35S-HDZ1-GFP、pCAMBIA35SHDZ2-GFP）和空載體質(zhì)粒（pCAMBIA35S）轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，注射煙草葉片進行瞬時表達，用熒光顯微鏡（Leica DM5000B）觀察，確定HDZ1和HDZ2在細胞中的作用部位.結(jié)果表明：在空載體對照中，GFP熒光信號在整個細胞中都有表達，無表達特異性，如圖3（a）和圖3（e）所示；在pCAMBIA35S-HDZ1-GFP融合瞬時表達中，GFP熒光信號與明場中的氣孔完全重合，如圖3b～3d所示，這說明HDZ1定位在氣孔細胞中，可能在植物的氣孔中發(fā)揮著重要作用；pCAMBIA35S-HDZ2-GFP融合瞬時表達細胞中，GFP熒光信號主要定位于煙草表皮細胞的細胞膜上，如圖 3（f）～圖 3（h）所示.

圖3 目的基因在煙草葉片下表皮細胞中的瞬時表達Fig.3 Transient expression of target genes in epidermal cells of leaf of tobacco

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）也稱反式作用因子（trans-acting factor），是一類能夠與DNA或RNA中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用激活或抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達[12].從蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析，典型的植物轉(zhuǎn)錄因子由核定位信號區(qū)（nuclear localization signal，NLS）、DNA 結(jié)合區(qū)（DNA binding domain，BD）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)（transcription regulation domain）和寡聚化位點區(qū)（oligomerization site）等4個功能區(qū)域組成[13].核定位信號區(qū)將轉(zhuǎn)錄因子定位到細胞核[14]，所以大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子定位在細胞核中，如擬南芥中的Roc5[15]、大豆中的GmERF5[16]、小麥中的W17[17]等.但也有例外，如擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子AtHsfA6a在細胞質(zhì)中的表達[18].目前，關(guān)于擬南芥HDZipⅢ轉(zhuǎn)錄因子家族亞細胞定位方面的研究很少，僅Zhong等[19]發(fā)現(xiàn)IFL基因定位在細胞核.在擬南芥的維管組織生長發(fā)育過程中，ATHB8具有促進維管組織分化的作用，過量表達會導(dǎo)致木質(zhì)素積累過多[13].REV、CAN、PHB和PHV可以調(diào)控頂端分生組織的分化和側(cè)部器官的極性，但REV與CAN、PHB、PHV在調(diào)控維管發(fā)育過程中作用相反[20].在葉片極性建立方面，REV和PHB的顯性突變體都出現(xiàn)了不同程度的近軸面化，產(chǎn)生了喇叭狀葉、棒狀葉和針狀葉[21].水稻HD-ZipⅢ家族基因與擬南芥HD-ZipⅢ家族基因具有同源性，在功能上可能也是調(diào)控頂端分生組織的分化和側(cè)部器官的極性.本課題組研究發(fā)現(xiàn)，水稻HDZ1轉(zhuǎn)錄因子定位在氣孔細胞中，猜測該基因可能在水稻葉片的生長發(fā)育中起到一定作用；HDZ2定位在細胞膜上，其功能尚不清楚.雖然HDZ1和HDZ2具有較高的同源性，但在水稻的生長發(fā)育中所起作用是否相同有待于進一步研究.

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