李丹彤，范友敏，常亞青，李曉麗，侯建華，曲誠(chéng)，胡昕江

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

刺參Apostichopus japonicus作為棘皮動(dòng)物門(mén)海參綱的一種，壁厚味美，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有滋補(bǔ)強(qiáng)身和藥用功能［1］。海參體壁因含有海參多糖、膠原蛋白和海參皂苷等多種生理活性物質(zhì)而成為海參主要的食用和藥用部位，其藥理活性主要包括抗真菌［2］、抗腫瘤［3］、抗凝血［4］、調(diào)節(jié)血脂濃度［5］和抗疲勞等作用［6］。20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)對(duì)刺參產(chǎn)品需求的增多，刺參已成為中國(guó)北方主要的海水養(yǎng)殖品種，但隨著中國(guó)刺參大規(guī)模人工養(yǎng)殖的快速發(fā)展，病害問(wèn)題日趨突出。目前，養(yǎng)殖業(yè)中防治病害普遍使用一些抗生素和化學(xué)藥物，但這些藥物易在刺參體內(nèi)殘留，影響刺參的食用品質(zhì)。因此，提高刺參自身的抗病力是防治刺參暴發(fā)疾病、保證刺參優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的根本途徑之一。Pedro等［7］采用脂多糖 (LPS)可以增強(qiáng)海參體腔細(xì)胞的吞噬活性;江曉路等［8］采用褐藻寡糖，王東梅等［9］采用復(fù)方中草藥等均可提高刺參免疫活性;熊川男等［10］認(rèn)為，利用凝集素作為海參免疫增強(qiáng)劑是防治海參病的一條有效途徑。

凝集素是一類(lèi)具有糖專(zhuān)一性、可促使細(xì)胞凝集的蛋白質(zhì)或糖蛋白，具有抗菌、激活淋巴細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等多種功能。Eliseikina等［11］已成功地利用甘露聚糖特異性凝集素來(lái)提高海參等棘皮動(dòng)物抗假結(jié)核耶爾森氏菌 (Yersinia Dseudotuberculosis)的能力。Eddie Ip等［12］研究表明，甘露糖結(jié)合凝集素 (MBL)與TLR2/6異聚體的協(xié)同作用能夠特異性地增強(qiáng)宿主金黃色葡萄球菌的應(yīng)答。李丹彤等［13-17］研究了裙帶菜、條斑紫菜、孔石莼和萱藻凝集素提取液對(duì)日本對(duì)蝦、鯉、鯽和刺參非特異性免疫功能的影響，劉云等［18］研究了兩種免疫多糖對(duì)刺參組織主要免疫酶活性的影響，均發(fā)現(xiàn)其具有明顯的增強(qiáng)作用。海帶和條斑紫菜的生物量較大，且其凝集素提取液活性較高，而有關(guān)凝集素提取液對(duì)刺參免疫活性物的誘導(dǎo)作用的報(bào)道較少。本研究中探究了海帶和條斑紫菜凝集素提取液對(duì)刺參組織主要免疫酶活性的影響，以期為水產(chǎn)動(dòng)物病害防治開(kāi)辟一條新的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刺參購(gòu)自大連皮口養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量為(3．50 ±1．95)g，體長(zhǎng)為 (4．05 ±0．95)cm。購(gòu)回后暫養(yǎng)于水槽 (30 L)中，共飼養(yǎng)14箱 (20頭/箱)。暫養(yǎng)期間，水溫為14℃，pH為8．0，海水鹽度為33，每日9:00投喂1次幼參配合飼料(購(gòu)于山東省蓬萊市蓬源飼料公司)并換水40%，7 d后用于試驗(yàn)。

試驗(yàn)用新鮮海帶長(zhǎng)約1 m，新鮮條斑紫菜長(zhǎng)約30 cm，均購(gòu)買(mǎi)于大連市黑石礁市場(chǎng)。試驗(yàn)用兔購(gòu)于大連醫(yī)科大學(xué)。

1.2 方法

1．2．1 凝集素提取液的制備 將海帶和條斑紫菜用過(guò)濾海水洗凈，用紗布和濾紙吸去水分，放入冰箱 (-20℃)中冷凍，然后置于干燥機(jī)中烘干(45℃)。將烘干的海帶、條斑紫菜用研缽研磨成粉末，放入自封袋內(nèi)保存。以1∶16(g∶mL)的比例將干粉用含 0．15 mol/L NaCl的 0．015 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液 (pH 7．2)于4℃下浸泡16 h，間歇性適當(dāng)攪拌，混合液倒入離心管中，在4℃下以4000 r/min離心30 min，離心后得到的上清液即為凝集素提取液。

1．2．2 蛋白含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn) ［19］中的方法，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 (用A280nm表示)，蛋白含量的測(cè)定用牛血清白蛋白作對(duì)照。

1．2．3 凝集活性的測(cè)定 從兔子的耳緣靜脈抽取兔血，用生理鹽水將其配制成體積分?jǐn)?shù)為2%的紅細(xì)胞懸液。在96孔V形血凝板上用40 μL生理鹽水和等量的凝集素提取液倍比稀釋后，加入40 μL 2%的紅細(xì)胞懸液，混勻并測(cè)定血凝活性。室溫下放置2 h后，若觀察到紅細(xì)胞沉積在V型孔底部呈大紅點(diǎn)狀，則說(shuō)明無(wú)凝集現(xiàn)象，若紅細(xì)胞呈網(wǎng)狀不下沉，表示有凝集現(xiàn)象。用能產(chǎn)生凝集現(xiàn)象的凝集素最大稀釋倍數(shù)或最小凝集素的量來(lái)表示血凝活性。

1．2．4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共設(shè)7組，每組設(shè)10個(gè)重復(fù)，每組放40頭刺參，在基礎(chǔ)飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0．64%、1．28%、2．56%的海帶凝集素提取液，或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1．88%、3．76%、7．52%的條斑紫菜凝集素提取液，分別投喂6個(gè)試驗(yàn)組刺參，以基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)組為對(duì)照。每天9:00換水1次，每次換水量為1/3～1/2，每天換水后投喂飼料 (投喂量按刺參體質(zhì)量的3% ～4%)，并測(cè)量鹽度、pH、溫度等各項(xiàng)水質(zhì)指標(biāo)，分別在投喂凝集素提取液后的第4、8、12、17天時(shí)測(cè)定刺參組織的各項(xiàng)免疫指標(biāo)。

1．2．5 樣品的制備 每次從各組取刺參10頭，測(cè)量其體長(zhǎng)，用滅菌的剪刀從刺參肛門(mén)沿腹處剪開(kāi)，用濾紙吸干體腔液，取體壁稱(chēng)重。按1∶3(g∶mL)的比例加入生理鹽水，用勻漿器研磨，在4℃下以12 000 r/min離心30 min，取上清，置于冰箱 (4℃)中保存?zhèn)溆?，試?yàn)中每只刺參均單獨(dú)測(cè)定免疫酶活性。

1．2．6 免疫酶活性的測(cè)定 CAT活性的測(cè)定依照桂遠(yuǎn)明等［20］的方法。CAT酶活力單位定義為:每分鐘分解1 μmol的過(guò)氧化氫 (H2O2)的量為1個(gè)酶活力單位 (U)。

LSZ活性的測(cè)定依照王雷等［21］的方法，用0．1 mol/L磷酸鉀鹽緩沖液 (pH 6．4)配成溶壁微球菌懸液 (A570nm=0．3)。取3 mL該懸液于試管中冰浴10 min后加入50 μL待測(cè)液，混勻，于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定 A0值，再將試液于37℃下水浴30 min，之后冰浴10 min中止反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)后的試液在570 nm波長(zhǎng)處的光密度值A(chǔ)。溶菌酶活力的計(jì)算公式為

AKP活力的測(cè)定采用磷酸苯二鈉法［20］。AKP酶活力單位定義為:樣品在37℃下與底物作用15 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)酶活力單位 (U)。

ACP活力的測(cè)定采用磷酸苯二鈉法［20］。ACP酶活力單位定義為:樣品在37℃下與底物作用60 min，產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)酶活力單位 (U)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 13．0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0．05。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝集素提取液的制備

在45℃下烘干海帶和條斑紫菜，制備海帶和條斑紫菜凝集素提取液，測(cè)得海帶凝集素提取液比活力為條斑紫菜凝集素提取液的1517．31倍 (表1)。

表1 海帶與條斑紫菜凝集素提取液的分離測(cè)定結(jié)果Tab.1 Separation of kelp Laminaria japonica Aresch and laver Porphyra yezoensis Veda lectins

2.2 海藻凝集素提取液對(duì)刺參體壁中CAT活性的影響

從表2可見(jiàn):投喂含海帶凝集素提取液的飼料后，除第4天時(shí)各試驗(yàn)組幼參的CAT活性小于對(duì)照組外，其余時(shí)間均比對(duì)照組高;第8天時(shí)，除2．56%試驗(yàn)組酶活性與對(duì)照組呈顯著性差異 (P＜0．05)外，其他試驗(yàn)組均與對(duì)照組呈極顯著性差異 (P＜0．01);第12天時(shí)，0．64%和1．28%試驗(yàn)組酶活性均與對(duì)照組呈極顯著性差異 (P＜0．01)且1．28%試驗(yàn)組酶活性最高，為對(duì)照組酶活性的1．11倍;第17天時(shí)，1．28%和2．56%凝集素對(duì)刺參體壁CAT活性具有顯著的誘導(dǎo)作用 (P＜0．05)。

投喂含條斑紫菜凝集素提取液的飼料后，第8天時(shí)各試驗(yàn)組刺參體壁CAT活性均有極顯著提高(P＜0．01);第12天時(shí)，1．88%組CAT活性有極顯著提高 (P＜0．01)且酶活性最高，為對(duì)照組酶活性的1．10倍，而3．76%和7．52%組酶活性均呈顯著提高 (P＜0．05);第17天時(shí)，試驗(yàn)組CAT酶活性均有顯著提高 (P＜0．05)。

從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果來(lái)看，在投喂含海帶和條斑紫菜凝集素提取液飼料的中后期，各組刺參體壁的CAT酶活性均顯著或極顯著提高。

2.3 海藻凝集素提取液對(duì)刺參體壁中LSZ活性的影響

從表2可見(jiàn):投喂海帶凝集素提取液后，第8天時(shí)，0．64%和2．56%組刺參LSZ活性顯著提高(P＜0．05)，而1．28%組則呈現(xiàn)極顯著提高 (P＜0．01);第12天和第17天時(shí)，3個(gè)試驗(yàn)組均有極顯著提高 (P＜0．01)，2．56%組在第17天時(shí)活性達(dá)到最高，是對(duì)照組的2．25倍。投喂條斑紫菜凝集素提取液后，僅7．52%組刺參LSZ活性在第8天時(shí)顯著提高 (P＜0．05)，其他3個(gè)試驗(yàn)組酶活性在第4、8、12、17天時(shí)均與對(duì)照組無(wú)顯著性差異 (P ＞0．05)。

從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果來(lái)看，投喂不同含量的海帶凝集素提取液，隨著時(shí)間的增加LSZ活性均顯著或極顯著提高，且比條斑紫菜凝集素提取液對(duì)刺參體壁LSZ活性的誘導(dǎo)作用大。

表2 海帶和條斑紫菜凝集素提取液對(duì)刺參體壁CAT和LSZ活性的影響 (n=10)Tab.2 Effects of kelp Laminaria japonica Aresch and laver Porphyra yezoensis Veda lectin extracted solution on catalase(CAT)and lysozyme(LSZ)activities in body walls of sea cucumber Apostichopus japonicus(n=10)

2.4 海藻凝集素提取液對(duì)刺參體壁中AKP活性的影響

從表3可見(jiàn):投喂含海帶凝集素提取液的飼料后，試驗(yàn)組幼參的AKP活性在第4、8、12、17天時(shí)均無(wú)顯著提高 (P＞0．05);投喂含條斑紫菜凝集素提取液飼料后，第4、17天時(shí)，7．52%組AKP活性極顯著提高 (P＜0．01)且在第4天時(shí)活性最高，其酶活性是對(duì)照組的1．42倍;第8、12天時(shí)3個(gè)試驗(yàn)組的酶活性在投喂期間無(wú)顯著性變化(P ＞0．05)。

從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果來(lái)看，投喂7．52%條斑紫菜凝集素提取液，AKP活性均比對(duì)照組高，并在第4、17天時(shí)有極顯著性差異，且比海帶凝集素提取液對(duì)刺參體壁AKP的誘導(dǎo)作用大。

2.5 海藻凝集素提取液對(duì)刺參體壁中ACP活性的影響

從表3可見(jiàn):投喂含海帶凝集素提取液的飼料后，第4天時(shí)試驗(yàn)組的ACP活性均低于對(duì)照組;第8、17天時(shí)僅0．64%組比對(duì)照組顯著提高 (P＜0．05)且在第17天時(shí)ACP活性最高，其酶活性是對(duì)照組的1．26倍。投喂含有條斑紫菜凝集素提取液的飼料后，第4、8天時(shí)，3個(gè)試驗(yàn)組ACP活性均與對(duì)照組無(wú)顯著性差異 (P＞0．05);第12天時(shí)，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比ACP活性均有所提高，其中7．52%組有極顯著性變化 (P＜0．01);第17天時(shí)，1．88%組和7．52%組酶活性較對(duì)照組極顯著提高 (P＜0．01)，3．76%組有顯著提高 (P＜0．05)，7．52%試驗(yàn)組在第12天時(shí)和第17天時(shí)分別為對(duì)照組的1．43倍和1．57倍。

從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果來(lái)看，投喂含條斑紫菜凝集素提取液飼料的后期，對(duì)刺參體壁ACP活性的影響明顯，比投喂含海帶凝集素提取液飼料的效果顯著。

表3 海帶和條斑紫菜凝集素提取液對(duì)刺參體壁AKP和ACP活性的影響 (n=10)Tab.3 Effects of kelp Laminaria japonica Aresch and laver Porphyra yezoensis Veda lectin extracted solution on alkaline phosphatase(AKP)and acid phosphatase(ACP)activities in body walls of sea cucumber Apostichopus japonicus(n=10)

3 討論

海帶屬于褐藻門(mén)、海帶科的一種常見(jiàn)食用海洋經(jīng)濟(jì)藻類(lèi)，條斑紫菜屬于紅藻門(mén)、原紅藻綱、紅毛菜科、Pyropia屬。兩種海藻凝集素提取液對(duì)刺參體壁4種酶活性的研究結(jié)果表明，試驗(yàn)組中加入海帶和條斑紫菜凝集素提取液能顯著提高刺參體壁中CAT、LSZ、AKP和ACP的活性，且最高酶活的最佳凝集素提取液濃度和誘導(dǎo)時(shí)間不同。這表明，海藻凝集素提取液是對(duì)刺參機(jī)體具有顯著免疫誘導(dǎo)功效的一種天然免疫增強(qiáng)劑。

CAT酶是存在于生物體內(nèi)非常重要的抗氧化防御性功能酶，體內(nèi)SOD清除過(guò)量O-2·產(chǎn)生過(guò)量的H2O2，H2O2可由CAT與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等一起消除，從而維持機(jī)體正常的機(jī)能［22］。本研究中，在投喂含不同含量的海帶和條斑紫菜凝集素提取液飼料的中后期，刺參體壁CAT酶活性均顯著或極顯著提高，說(shuō)明機(jī)體抗氧化能力顯著提高。

LSZ酶是非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，主要參與機(jī)體中非特異性免疫的殺菌作用，水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的β-1，4糖苷鍵。當(dāng)機(jī)體受到病原等外界刺激時(shí)，吞噬細(xì)胞活性增強(qiáng)并進(jìn)行異物吞噬，因吞噬細(xì)胞含有LSZ，此時(shí)LSZ活性也隨之變化［23-24］。本研究中，投喂不同含量的海帶凝集素提取液，隨著時(shí)間的增加LSZ活性均顯著或極顯著提高，這一結(jié)果與李丹彤等［17］研究的萱藻和裙帶菜凝集素提取液作為免疫增強(qiáng)劑對(duì)刺參進(jìn)行免疫誘導(dǎo)所得結(jié)論相近。海帶凝集素提取液促進(jìn)刺參LSZ活性上升的原因，可能是當(dāng)用含海帶凝集素提取液的飼料投喂刺參后，可激活吞噬細(xì)胞的吞噬功能和LSZ活性，刺激免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，啟動(dòng)免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)刺參免疫能力［25］。金思等［26］在試驗(yàn)飼料中添加不同濃度的殼聚糖后測(cè)定香魚(yú)LSZ活性和hsp70基因的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香魚(yú)肝臟、脾臟和腎臟中hsp70的表達(dá)量均較對(duì)照組升高，投喂殼聚糖后LSZ活性與hsp70的表達(dá)量呈正相關(guān)。hsp70基因家族是最重要且被最廣泛研究的熱激蛋白基因家族，參與生物體的多種免疫應(yīng)答過(guò)程，推測(cè)海帶凝集素提取液提高刺參LSZ活性與hsp70有一定的相關(guān)性。

AKP酶在體內(nèi)細(xì)胞代謝過(guò)程中具有重要作用，可以催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，還可以催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。其不僅參加鈣磷代謝，維持體內(nèi)適宜的鈣磷比例，而且還與貝類(lèi)角蛋白等蛋白質(zhì)的分泌相關(guān)［27］，同時(shí)其作為軟體動(dòng)物溶酶體酶的重要組成部分，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用［28-29］。本研究中，投喂7．52%條斑紫菜凝集素提取液后，AKP活性有顯著提高，且比海帶凝集素提取液對(duì)刺參體壁AKP的誘導(dǎo)作用大，推測(cè)條斑紫菜凝集素提取液可以通過(guò)提高AKP活性，提高刺參免疫活性。由于條斑紫菜凝集素提取液與海帶凝集素提取液的結(jié)構(gòu)組成不同，造成其對(duì)刺參體壁AKP活性的激活作用也不同。

ACP酶是溶酶體的重要組成部分，是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，可用ACP活性表示吞噬細(xì)胞清除異物的能力［9］。本研究中，投喂條斑紫菜和海帶凝集素提取液的中后期，ACP活性均有顯著或極顯著提高，且在后期投喂條斑紫菜比投喂海帶凝集素提取液提高得更顯著。Rawal等［30］研究表明，阿米巴Gal/GalNAc專(zhuān)一凝集素對(duì)MAPK激酶途徑有激活作用，MAPK進(jìn)入細(xì)胞核，可使其轉(zhuǎn)錄因子活化。由此推測(cè)，這可能也是條斑紫菜和海帶凝集素提取液顯著提高刺參ACP活性的機(jī)理，有待于進(jìn)一步研究。

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