劉超梅，胡曉冬，邢紅英，郭素芳，李雪梅，楊曉波，肖 麗

近年來，鮑曼不動(dòng)桿菌(acinetobacter baumannii)引起的醫(yī)院感染日益突出［1-4］，其主要流行克隆株的監(jiān)測(cè)及定義已成為分子流行病學(xué)學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)［5-6］。有研究依據(jù)AFLP分型方法將鮑曼不動(dòng)桿菌的流行菌株分別定義為歐洲克隆譜系Ⅰ、Ⅱ和

Ⅲ［7］;而英國(guó)學(xué)者 Turton等［8］依據(jù)脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型方法發(fā)現(xiàn)了SE克隆系、OXA-23克隆系1和2。Turton等［9］基于序列分型的多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確而快速地對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的同源性進(jìn)行分析，該研究將上述不同的克隆譜系分為3組(Group 1、Group 2和 Group 3)，Group 1包括SE克隆系、歐洲克隆譜系Ⅱ及OXA-23克隆系1，Group 2包括歐洲克隆譜系Ⅰ、OXA-23克隆系2等，而Group 3主要包括歐洲克隆譜系Ⅲ。本文對(duì)不重復(fù)鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行同源性分析，了解其主要流行克隆株的分子特征，為控制醫(yī)院感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 將解放軍253醫(yī)院2010年6月—2012年12月臨床分離的74株不重復(fù)鮑曼不動(dòng)桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，標(biāo)本來源:痰32例，尿16例，創(chuàng)面或傷口分泌物13例，血液10例，腦脊液3例。

1.2 引物合成及PCR擴(kuò)增 多種耐藥基因、Group 1和Group 2多重PCR引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增方法參照文獻(xiàn)［10-12］，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR產(chǎn)物在含0．5μg/ml溴化乙啶(EB)的1．5%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果，每次PCR檢測(cè)均設(shè)陰性對(duì)照。同時(shí)于陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物中隨機(jī)抽取3株，送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過GenBank(http://blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi)比對(duì)分析。

1.3 PFGE實(shí)驗(yàn)方法 按國(guó)家疾病控制中心傳染病所PulseNet China網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室提供的鮑曼不動(dòng)桿菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行操作，具體實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果分析參照文獻(xiàn)［13］。

1.4 克隆菌株聚類分析 基于序列分型的多重PCR方法鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌的主要流行克隆譜系，結(jié)果判定參照文獻(xiàn)［12］。PFGE實(shí)驗(yàn)得到74株鮑曼不動(dòng)桿菌的DNA指紋圖譜，用BioNumerics軟件對(duì)各菌株間進(jìn)行聚類分析，將相似性系數(shù)87%作為不同型別的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，相似度＞87%為同一亞型，代表同一克隆株;＜87%為不同的基因型，代表不同的克隆株。

1.5 多重耐藥相關(guān)基因譜分析 應(yīng)用PCR及測(cè)序方法［10-12］檢測(cè)10種多重耐藥相關(guān)基因(blaOXA-51-like、blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-58-like、blaTEM、blaampC、armA、ISA ba1、intI 1 和 intI 2)的攜帶情況。

2 結(jié)果

2.1 Group PCR序列分型結(jié)果 74株鮑曼不動(dòng)桿菌分為 6種 Group序列型(SG)，其中 57株(77.0%)為 Group SG1，4 株(5.4%)為 Group SG4，8株(10.8%)為 Group SG5，2株(2.7%)為 Group SG9，1 株(1.4%)為 Group SG11，2 株(2.7%)為Group SG13。

2.2 克隆菌株聚類分析結(jié)果 74株鮑曼不動(dòng)桿菌的PFGE帶型表現(xiàn)出多樣性，可大致分為13種圖譜，其中 A型35株、B型17株、C型7株、D型5株，其余型別10株。74株鮑曼不動(dòng)桿菌克隆菌株聚類分析樹狀圖見圖1。

2.3 鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥相關(guān)基因譜的分布情況 blaOXA-51-like在所有菌株中均為陽(yáng)性，除blaOXA-24-like、blaOXA-58-like和 intI 2基因?yàn)殛幮酝猓溆喽嘀啬退幭嚓P(guān)基因均有陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，通過陽(yáng)性菌株數(shù)所占實(shí)驗(yàn)菌株數(shù)的比例獲得耐藥相關(guān)基因的陽(yáng)性率，耐藥相關(guān)基因 blaOXA-23-like、blaTEM、blaampC、armA、ISA ba1和intI 1的陽(yáng)性率分別為54．1%(40/74)、86．5%(64/74)、66．2%(49/74)、89．2%(66/74)、90．5%(67/74)和85．1%(63/74)，并且測(cè)序結(jié)果與GenBank庫(kù)中的已知序列具有高度的一致性。多種耐藥基因在不同PFGE型中的分布情況見表1。結(jié)果顯示，多種耐藥基因在A型和B型菌種中的分布比較集中，同一耐藥基因在不同PFGE型中呈現(xiàn)出交叉分布現(xiàn)象。

表1 74株鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥相關(guān)基因在不同PFGE型別中的分布情況(株)

圖1 74株鮑曼不動(dòng)桿菌克隆菌株聚類分析樹狀圖

3 討論

在鮑曼不動(dòng)桿菌的流行病學(xué)調(diào)查和預(yù)防控制研究方面，尤其是在醫(yī)院感染暴發(fā)期間，為了證實(shí)是否存在其克隆株的傳播流行，實(shí)現(xiàn)感染源的溯源，迫切需要選用一種行之有效的基因分型方法?；赟G的多重PCR方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果容易判讀，無需進(jìn)一步測(cè)序或應(yīng)用其他分型技術(shù)，非常適合于臨床實(shí)驗(yàn)室快速準(zhǔn)確地鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌流行菌株的SG或克隆系，從而有助于實(shí)時(shí)掌控鮑曼不動(dòng)桿菌院內(nèi)感染發(fā)生的流行趨勢(shì)。

本研究結(jié)果顯示，本組鮑曼不動(dòng)桿菌克隆譜系以Group GS1為主，占77．0%。根據(jù)Group GS1對(duì)應(yīng)于歐洲克隆譜系Ⅱ的結(jié)果判斷依據(jù)，解放軍253醫(yī)院臨床分離的74株鮑曼不動(dòng)桿菌的流行克隆譜系主要為歐洲克隆譜系Ⅱ，該譜系是鮑曼不動(dòng)桿菌最大的流行克隆系，在全世界不同國(guó)家均有分布。

目前，多種基因分型技術(shù)在鮑曼不動(dòng)桿菌菌株分型中得到了廣泛應(yīng)用［14-18］，其中PFGE被譽(yù)為細(xì)菌分子流行病學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”［19］。本研究對(duì)74株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行了PFGE分型，在87%的相似性水平上，共得到13種PFGE圖譜，顯示出高度多樣性，其中A型和B型為主要型別，分別占總菌株數(shù)的 47．3%(35/74)和 23．0%(17/74)，說明在解放軍253醫(yī)院住院患者中存在鮑曼不動(dòng)桿菌主要克隆株的流行。因此，需要臨床醫(yī)生能快速、實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)、追蹤鮑曼不動(dòng)桿菌主要流行克隆株的變化趨勢(shì)，并采取合理措施預(yù)防和控制其傳播，尤其要防控醫(yī)院感染的流行或暴發(fā)。

鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥呈逐年上升趨勢(shì)［20-23］，OXA類碳青霉烯酶、插入序列、整合子、ampC酶、超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)等在鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥機(jī)制方面發(fā)揮著重要的作用［24-25］。本研究結(jié)果顯示，40株(54．1%)鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶有blaOXA-23-like基因，進(jìn)一步證實(shí)耐碳青霉烯類的鮑曼不動(dòng)桿菌以產(chǎn) OXA-23型碳青霉烯酶為主［10］;在66.2%的菌株中檢出blaampC基因，86．5%的菌株中檢出blaTEM基因，可見對(duì)于本組分離的鮑曼不動(dòng)桿菌，blaTEM的檢出率高于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)水平［12］。通過檢測(cè)整合酶基因可以篩查和鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥性［26］。在本研究74株鮑曼不動(dòng)桿菌中僅檢測(cè)出intI 1，未發(fā)現(xiàn)intI 2，說明本組鮑曼不動(dòng)桿菌主要攜帶Ⅰ類整合子，檢出率高達(dá)85．1%。在鮑曼不動(dòng)桿菌中，ISA ba1通過提供啟動(dòng)子序列來增強(qiáng)β內(nèi)酰胺酶的表達(dá)［27］，ADC型ampCβ內(nèi)酰胺酶和OXA類碳青霉烯酶基因的上游經(jīng)常發(fā)現(xiàn)存在有ISA ba1，本研究中插入序列ISA ba1的檢出率高達(dá)90．5%。16SrRNA甲基化酶基因armA絕大多數(shù)位于整合子、質(zhì)粒等可移性遺傳元件上，易于在細(xì)菌間傳播，與阿米卡星的耐藥性密切相關(guān)，本研究74株實(shí)驗(yàn)菌株中89．2%的菌株攜帶此基因。

本研究對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥相關(guān)基因在不同PFGE型別中的分布特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在不同的PFGE型別中同一耐藥基因呈現(xiàn)出交叉分布現(xiàn)象，進(jìn)一步說明了在具有不同遺傳背景的鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)生著耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移。

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