梁偉民 郭衛(wèi) 燕太強(qiáng) 楊榮利

三氧化二砷影響人骨肉瘤細(xì)胞自噬現(xiàn)象的實驗研究

梁偉民 郭衛(wèi) 燕太強(qiáng) 楊榮利

目的探討三氧化二砷( AS2O3)對人骨肉瘤細(xì)胞( HOS，MG63 )自噬現(xiàn)象的影響。方法用MTT 法觀察 AS2O3對 HOS、MG63 細(xì)胞活力的作用；用透射電鏡、免疫熒光染色、Western blot 檢測 HOS、MG63 細(xì)胞基礎(chǔ)自噬以及 AS2O3誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的情況。結(jié)果透射電鏡、免疫熒光染色、Western blot 結(jié)果顯示 MG63 基礎(chǔ)自噬水平明顯高于 HOS( P＜0.01 )；AS2O3抑制 MG63 細(xì)胞活力的 IC50值 15.42 μmol / L 明顯大于AS2O3抑制 HOS 細(xì)胞的活力的 IC50值 1.067 μmol / L，多耐藥株 MG63 較 HOS 對 AS2O3耐藥；檢測 LC3-II 及PARP 蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，隨著 HOS 自噬水平的增加，HOS 的凋亡逐漸增加，而 AS2O3通過促進(jìn) MG63 的保護(hù)性自噬延緩了凋亡的發(fā)生。結(jié)論AS2O3可引起骨肉瘤細(xì)胞自噬，對不同的骨肉瘤細(xì)胞自噬的影響各不相同。對于化療耐藥的骨肉瘤細(xì)胞 MG63，AS2O3誘導(dǎo)的自噬是保護(hù)性自噬，自噬延緩了凋亡的發(fā)生；而對于化療敏感的 HOS 細(xì)胞，AS2O3誘導(dǎo)的自噬促進(jìn)了凋亡的發(fā)生。

自噬；骨肉瘤；細(xì)胞系，腫瘤；三氧化二砷

骨肉瘤是青少年最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，目前采取“術(shù)前化療＋手術(shù)＋術(shù)后化療”的綜合治療方法，5 年生存率由過去的不足 20% 提高到目前的60%～70%[1]。然而化療藥物的多藥耐藥( multidrug resistance，MDR )使得骨肉瘤容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響了其臨床療效和骨肉瘤患者的長期生存率[2]。三氧化二砷( AS2O3)最早在治療急性早幼粒白血病中取得了巨大進(jìn)展，目前已作為治療 III 期骨肉瘤的化療藥物，并取得了較好的短期療效[3]。由于 AS2O3耐藥，從而會影響治療效果。真核細(xì)胞中存在兩種蛋白降解途徑：一種是通過蛋白酶體降解；另一種是通過細(xì)胞自噬的溶酶體降解。細(xì)胞成份更新、保持正常的生理狀態(tài)都依賴于細(xì)胞自噬的發(fā)生，自噬可以作為保護(hù)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥的生存機(jī)制[4]。自噬是一種在細(xì)胞中普遍存在的生命現(xiàn)象，化療藥物在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時，也能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，自噬既能作為保護(hù)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥的生存機(jī)制，也能與凋亡共同參與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[5]。因此，我們通過兩種骨肉瘤細(xì)胞系 HOS( 化療敏感株 )和 MG63( 多耐藥株 )來研究AS2O3對人骨肉瘤細(xì)胞自噬現(xiàn)象的作用。

資料與方法

一、細(xì)胞、試劑及抗體

MG63 及 HOS 細(xì)胞系均購自美國 ATCC 公司；RPMI-DMEM 培養(yǎng)液胎牛血清購自美國 HyClone公司；噻唑藍(lán)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；AS2O3、Anti-LC3 抗體、Anti-P62 抗體購自 Sigma 公司；Anti-PARP 購自 Cell Signaling 公司；VDF 5 膜購自 Amersham 公司；發(fā)光液購自 Thermo 公司。

二、儀器設(shè)備

電子顯微鏡( Hitachi 公司，日本 )、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱( NUAIRE 公司，美國 )、Mini Trans-Blot 電轉(zhuǎn)儀( Bio-RAD 公司，美國 )、AE-65009 型電泳槽( ATTO 公司，日本 )、恒壓恒流電泳儀( JY600C，JUNYI 公司 )。

三、方法

1. MG63 及 HOS 細(xì)胞培養(yǎng)：兩種細(xì)胞系均用含10% 胎牛血清的 RPMI-DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)( 37 ℃ 培養(yǎng)箱、5% CO2)，每 3 天傳代 1 次。

2. 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞自噬情況：透射電子顯微鏡是檢測自噬最可靠和廣泛使用的方法。電鏡下可看到單層或雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，內(nèi)含細(xì)胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片等。自噬體是自噬發(fā)生的特征，自噬體的數(shù)量與自噬活性正相關(guān)[6]。

將骨肉瘤細(xì)胞 MG63、HOS 細(xì)胞分別接種于6 cm 培養(yǎng)皿上，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，至細(xì)胞混合度達(dá) 60%～70% 時換無血清培養(yǎng)基。用胰酶消化細(xì)胞，4 ℃、1000 g 離心 5 min 收集細(xì)胞，冷 PBS 洗滌 2 遍，加入 3% 戊二醛，4 ℃30 min 固定，送樣檢驗，電鏡觀察細(xì)胞自噬情況。

3. 免疫熒光染色觀察細(xì)胞膜 GFP-LC3 表達(dá)：綠色熒光蛋白 GFP-LC3 是一種自噬體標(biāo)記物，GFPLC3 以酯化形式結(jié)合在自噬泡上，呈明顯的點狀分布，一個熒光點表示為一個自噬體[7]。

將骨肉瘤 MG63、HOS 細(xì)胞接種到 6 孔板內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)過夜，至細(xì)胞混合度達(dá)到 60%～70%。用lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染 GFP-LC3 質(zhì)粒 DNA，6 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，取出爬片，用 4% 多聚甲醛室溫固定 10～15 min，PBS 洗 3 遍，封片。熒光顯微鏡下觀察，對 GFP-LC3 的陽性點數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。

4. 蛋白質(zhì)印跡法( Western blot )檢測 P62、LC3、PARP 蛋白的表達(dá)：P62 作為自噬特異性的底物，當(dāng)自噬被抑制時，P62 不再降解而積累起來，因此 P62 水平的變化能反應(yīng)自噬流的變化[8]，P62 的含量與細(xì)胞自噬活性呈負(fù)相關(guān)。LC3-II 是目前公認(rèn)的自噬體相關(guān)的標(biāo)記蛋白，LC3-II / β-Actin比值能很好地反應(yīng)自噬的變化情況[7]。LC3 在細(xì)胞中有兩種形式，即胞漿型 LC3( LC3-I )與膜型 LC3( LC3-II )。細(xì)胞自噬活性升高時，細(xì)胞內(nèi) LC3 的含量及 LC3-I 向 LC3-II 的轉(zhuǎn)化均明顯增加，LC3-II 或LC3-II / I 比值的大小與細(xì)胞自噬活性正相關(guān)[9]。

PBS 將各組細(xì)胞洗滌 3 遍，蛋白提取液提取蛋白，測定蛋白濃度。各組細(xì)胞取 25 μg，10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，200 mA 轉(zhuǎn)膜 1 h，用 5% 脫脂奶粉 / TBS( 0. 05% Tween20，125 mmol / L NaCl，25 mmol / L Tris，pH7.5 )封閉 1 h，兔抗人 P62、LC3和 PARP 孵育 4 ℃ 過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記第二抗體孵育 1 h，ECL 顯色，β-Actin 管家基因作為內(nèi)參。

5. MTT 法檢測 AS2O3對 MG63 及 HOS 細(xì)胞增殖的影響：分別取傳代穩(wěn)定后的骨肉瘤細(xì)胞 MG63、HOS 以 3.5×105/ ml 的細(xì)胞濃度接種于 96 孔板上，每孔體積為 200 μl。培養(yǎng) 24 h 后，按實驗要求加入不同濃度的 AS2O3，以 0、0.5、1、2、4、6、12 μmol / L 處理 MG63，以 0、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0 μmol / L 處理 HOS，每種濃度設(shè) 4 個平行孔，并設(shè)空白對照。于加藥后 24 h 向每孔加入 MTT液 20 μl( 5 mg / ml )繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸去上清液，每孔加二甲基亞楓( DMSO )150 μl 避光振蕩 10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀在 490 nm 波長下檢測各孔吸光度值( OD490 )。將所得結(jié)果繪制直方圖，用藥物濃度的對數(shù)值與細(xì)胞抑制率做線性回歸計算 AS2O3對 MG63及 HOS 細(xì)胞的藥物半數(shù)抑制濃度( IC50)。細(xì)胞存活率( % )＝加藥組 OD 值 / 對照組 OD 值×100%。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

以上實驗均獨(dú)立重復(fù) 3 次。Western blot 條帶的灰度測量采用 Image Lab 軟件。實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 18.0 軟件進(jìn)行兩個獨(dú)立樣本 t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MG63 及 HOS 的基礎(chǔ)自噬水平

1. 透射電鏡觀察 HOS、MG63 細(xì)胞自噬情況：透射電鏡結(jié)果顯示，HOS 細(xì)胞，自噬處于較低水平，細(xì)胞內(nèi)自噬體較少；而 MG63 自噬水平較高，出現(xiàn)較多自噬泡和自噬體( 圖1 )。

2. 熒光顯微鏡下觀察自噬標(biāo)記蛋白 GFP-LC3 表達(dá)：在多耐藥株 MG63 中每視野 GFP-LC3 陽性點數(shù)為( 183±49 )，化療敏感株 HOS 中每視野 GFP-LC3為( 12±2 )，MG63 較 HOS 細(xì)胞株表達(dá)量明顯要高，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0.01 )( 圖2 )。

3. 長壽蛋白 P62 / β-Actin 及 LC3-II / β-Actin比值的變化情況：MG63 細(xì)胞的 P62 / β-actin 值( 0.37±0.05 )低于 HOS 細(xì)胞的 P62 / β-actin 值( 0.95±0.20 )，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0.01 )；MG63 細(xì)胞的 LC3-II / β-Actin 值( 0.81±0.10 )高于HOS 中 LC3-II / β-Actin 值( 0.24±0.05 )，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0.01 )?？梢?，在 MG63 細(xì)胞中，P62 表達(dá)水平較 HOS 低，而 LC3-II 表達(dá)水平較 HOS增高，這說明 MG63 細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬活性較 HOS 細(xì)胞高( 圖3 )。

二、AS2O3對 HOS 及 MG63 細(xì)胞活力的影響

MTT 結(jié)果顯示，HOS 及 MG63 在不同濃度 AS2O3處理后，細(xì)胞活力均受抑制，并且呈濃度依賴性( 圖4a )。對于 HOS 細(xì)胞，AS2O3濃度為 0.4 μmol / L時與對照組( 不加 AS2O3組 )相比，能夠有效地抑制細(xì)胞活性( P＜0.05 )，AS2O3濃度為 1.0 μmol / L 時顯著抑制細(xì)胞活性( P＜0.01 )；而對于 MG63 細(xì)胞，AS2O3濃度為 6 μmol / L 時與對照組相比，能夠有效地抑制細(xì)胞活性( P＜0.05 )，AS2O3濃度為 12 μmol / L時顯著抑制細(xì)胞活性( P＜0.01 )。為進(jìn)一步分析AS2O3對 HOS 及 MG63 細(xì)胞活力的影響，我們用SPSS 軟件計算兩種細(xì)胞系的 IC50。發(fā)現(xiàn) AS2O3抑制HOS 細(xì)胞活性的 IC50為 1.067 μmol / L，而 AS2O3抑制 MG63 細(xì)胞活性的 IC50為 15.42 μmol / L( 圖4b )。結(jié)果顯示，AS2O3對 MG63 較 HOS 耐藥，這與 ATCC上關(guān)于兩種細(xì)胞耐藥性的描述是一致的[10-11]。

圖1 透射電鏡觀察 HOS、MG63細(xì)胞自噬體 a：HOS( ×8200 )；b：MG63( ×8200 )；c：箭頭所示為MG63 自噬體( ×16500 )Fig.1 Autophagosomes of HOS and MG63 cells were observed under transmission electron microscope a: HOS( ×8200 ); b: MG63( ×8200 ); c: Autophagosomes were indicated by the arrows( ×16500 )

圖2 免疫熒光染色觀察細(xì)胞膜 GFPLC3 表達(dá)，檢測 HOS、MG63 細(xì)胞自噬情況 a：HOS 熒光顯微鏡圖( ×400 )；b：MG63 熒光顯微鏡圖( ×400 )；c：直方圖(**P ＜ 0.01 )Fig.2 The expressions of Green Fluorescent Protein( GFP )-LC3 in HOS and MG63 cells were determined by immunofluorescent staining to observe

圖3 Western blot 檢測 HOS、MG63細(xì)胞 P62、LC3-I、LC3-II 蛋白相對表達(dá)情況 a：電泳圖；b～c：直方圖(**P ＜ 0.01 )Fig.3 The relative expressions of P62, LC3-I and LC3-II proteins in HOS and MG63 cells were detected by Western blot assay a: Electrophoretogram; b-c: Histogram(**P＜0.01 )

圖4 AS2O3對 HOS、MG63 細(xì)胞活力的影響 a：AS2O3對 HOS 細(xì)胞活力的影響；b：AS2O3對 MG63 細(xì)胞活力的影響( 與對照組0 μmol / L 相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 )Fig.4 The effects of AS2O3on osteosarcoma cell viability a: The effects of AS2O3on HOS cell viability; b: The effects of AS2O3on MG63 cell viability(*P＜0.05,**P＜0.01, when compared with 0 μmol/L in the control group )

圖5 Western blotting 檢測 AS2O3誘導(dǎo) HOS、MG63 自噬及凋亡的情況 a：AS2O3誘導(dǎo) HOS 自噬及凋亡的情況；b：AS2O3誘導(dǎo) MG63自噬及凋亡的情況Fig.5 The AS2O3-induced autophagy and apoptosis were detested by Western blot assay a: AS2O3-induced autophagy and apoptosis in HOS cells; b: AS2O3-induced autophagy and apoptosis in MG63 cells

三、不同濃度 AS2O3對 HOS 及 MG63 自噬及凋亡的影響

多聚 ADP 核糖聚合酶( poly ADP-ribose polymerase，PARP )是細(xì)胞早期凋亡的標(biāo)記蛋白[12]，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn) PARP 切割，說明細(xì)胞內(nèi)啟動了凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。結(jié)合 Western blot 及灰度值直方圖( 圖5 )，顯示：隨著 AS2O3濃度的升高，HOS 細(xì)胞的自噬活性逐漸增高，至 0.6 μmol / L 時，PARP 發(fā)生了切割，說明發(fā)生了早期凋亡；而 MG63 的自噬活性隨著 AS2O3濃度的升高也在升高，至 2.0 μmol / L 時，自噬活性達(dá)到最高，此后隨著 AS2O3濃度的升高，自噬活性出現(xiàn)了降低，至 6.0 μmol / L 時，細(xì)胞自噬活性已低于基礎(chǔ)自噬活性，此時 PARP 發(fā)生了切割。發(fā)現(xiàn) AS2O3可促進(jìn) HOS 自噬的發(fā)生，但隨著細(xì)胞自噬水平的增加，HOS 的凋亡逐漸增加；AS2O3也可促進(jìn) MG63 細(xì)胞自噬，隨著 AS2O3濃度的增加，細(xì)胞自噬水平也增加，直到零界點 6.0 μmol / L時，才發(fā)生細(xì)胞凋亡。

討 論

化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的主要途徑是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[13]?；熯€可引起腫瘤細(xì)胞其它非凋亡形式的死亡，如：自噬、壞死、細(xì)胞衰老以及有絲分裂突變等[14]?；熕幬镎T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生，即可與凋亡共同誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，也可作為腫瘤細(xì)胞在不利環(huán)境下進(jìn)行自我保護(hù)的生存機(jī)制[15-17]?；熕幬镌诠侨饬鲋委熤械牡匚挥绕渲匾颊邔熕幬锊幻舾?，則預(yù)后較差[18]。AS2O3最早用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病，我們前期實驗證明 AS2O3在體外能明顯、有效地抑制骨肉瘤細(xì)胞的運(yùn)動、遷移和侵襲[19]，臨床應(yīng)用 AS2O3治療轉(zhuǎn)移性成骨肉瘤取得了滿意的臨床療效[3,20]。但 AS2O3具體抗腫瘤機(jī)制目前尚不清楚，有報道認(rèn)為與其誘導(dǎo)凋亡有關(guān)[21]。而 AS2O3可否引起細(xì)胞自噬的發(fā)生，國內(nèi)外報道較少。我們通過檢測凋亡相關(guān)蛋白 PARP、自噬標(biāo)記蛋白 LC3 的變化，發(fā)現(xiàn) AS2O3既可誘導(dǎo)MG63、HOS 這兩種骨肉瘤細(xì)胞凋亡，也可促進(jìn)自噬的發(fā)生。

自噬和凋亡同為細(xì)胞程序性死亡的方式，自噬也被稱為 II 型程序性死亡。自噬和凋亡可相互促進(jìn)，也可各自獨(dú)立存在[22]。Kanzawa 等[23]研究發(fā)現(xiàn)小劑量( ≤2 mmol / L )AS2O3處理惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系后，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了自噬性的細(xì)胞死亡，而不是凋亡。我們推測，對于 AS2O3相對不耐藥的 HOS細(xì)胞，隨著自噬水平的提高，可能促進(jìn)了凋亡的發(fā)生，從而與凋亡共同誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，來發(fā)揮抗腫瘤療效；而對于 AS2O3耐藥的 MG63 細(xì)胞，自噬可能作為保護(hù)腫瘤細(xì)胞抑制凋亡的生存機(jī)制，是保護(hù)性自噬。

促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡是化療藥物抗腫瘤的重要機(jī)制之一，腫瘤細(xì)胞凋亡受到抑制或凋亡易感性降低是耐藥的原因之一[24]?；熕幬镎T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生的保護(hù)性自噬，能抑制凋亡，從而發(fā)生耐藥。而抑制腫瘤細(xì)胞的保護(hù)性自噬，可能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。我們發(fā)現(xiàn) MG63 較 HOS 對 AS2O3耐藥，AS2O3通過促進(jìn) MG63 的保護(hù)性自噬延緩了凋亡的發(fā)生，推測自噬可能在 MG63 對 AS2O3化療耐藥中起到了一定的保護(hù)作用。Zhang 等[25]用 AS2O3和氯喹處理胃癌細(xì)胞 mgc-083，結(jié)果顯示，AS2O3可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性自噬，抑制凋亡；而兩藥聯(lián)合處理胃癌細(xì)胞后，細(xì)胞的自噬減少，而凋亡增加。

以上研究結(jié)果表明，AS2O3可引起骨肉瘤細(xì)胞自噬，對不同的細(xì)胞誘導(dǎo)自噬或者降低自噬都可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到治療骨肉瘤的目的；也可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性自噬，延緩凋亡的發(fā)生，但是其具體調(diào)控機(jī)制目前仍不明確。本研究還發(fā)現(xiàn)，自噬在不同的骨肉瘤細(xì)胞中起著不同的作用，對 AS2O3化療耐藥的骨肉瘤細(xì)胞系基礎(chǔ)自噬水平較高，隨著細(xì)胞自噬水平的降低，可降低骨肉瘤細(xì)胞的耐藥性，提示自噬可能是骨肉瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制之一，有待通過進(jìn)一步加入自噬抑制劑和自噬增強(qiáng)劑來驗證。相信隨著對自噬與骨肉瘤關(guān)系不斷深入地了解，可為骨肉瘤發(fā)病機(jī)制的研究以及骨肉瘤的臨床治療提供新的思路。

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( 本文編輯：代琴 )

An experimental research on the effects of arsenic trioxide on autophagy in human osteosarcoma cells

LIANG Wei-min, GUO Wei, YAN Tai-qiang, YANG Rong-li. Musculoskeletal Tumor Center, Peking University People’s Hospital, Beijing, 100044, PRC

ObjectiveTo explore the effects of arsenic trioxide( AS2O3)on autophagy in human osteosarcoma cells( HOS, MG63 ).MethodsThe effects of AS2O3on the viability of HOS and MG63 cells were detected by 3-( 4,5-Dimethylthiazol-2-yl )-2,5-diphenyltetrazolium bromide( MTT )assay. The basal and AS2O3-induced levels of autophagy were observed by transmission electron microscope, immunofluorescent staining and Western blot assay.ResultsThe examination results of transmission electron microscope, immunofuorescent staining and Western blot assay showed the basal level of autophagy of MG63 cells was higher than that of HOS cells( P＜0.01 ). The half maximal inhibitory concentration( IC50)value of AS2O3on MG63 cells was 15.42 μmol/L, which was obviously higher than 1.067 μmol/L of IC50value of AS2O3on HOS cells. HOS cells were more sensitive to AS2O3than MG63 cells. The protein expression levels of microtubule-associated protein 1 light chain 3( LC3 )-II and poly-ADP-ribose polymerase( PARP )were detected. The apoptosis was gradually serious with the improvement of AS2O3-induced autophagy in HOS cells, but AS2O3-induced autophagy protected the MG63 cells from apoptosis.ConclusionsThe AS2O3-induced autophagy plays different roles in osteosarcoma cells, and the apoptosis of tumor cells can be promoted so as to achieve the aim of erase osteosarcoma. For MG63 cells of chemotherapy resistance, the AS2O3-induced autophagy is protective, and the apoptosis will be delayed by autophagy. As to HOS cells of chemotherapy sensitivity, the apoptosis will be induced by autophagy

Autophagy; Osteosarcoma; Cell line, tumor; Arsenic trioxide( AS2O3)

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.05.008

R738.1

國家自然科學(xué)基金資助項目( 81172543 )

100044 北京大學(xué)人民醫(yī)院骨與軟組織腫瘤診療中心暨骨腫瘤科

郭衛(wèi)，Email: bonetumor@163.com

2014-01-07 )