王 微，闞建全,2,3,

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（重慶），重慶 400715）

鲊?yán)苯肥谴?、鄂、湘、黔等地區(qū)的一種傳統(tǒng)特色食品，是以新鮮的紅辣椒和玉米粉為主要原料，加一定的輔料拌合后自然發(fā)酵而成，成品微酸微辣、香氣特殊、回味醇厚，保存期相對較長。鲊?yán)苯酚址Q鲊金椒，鲊海椒、鲊廣椒，是鲊菜之母，既可單獨(dú)成菜，也可用其作為原料加工成許多鲊菜。因其獨(dú)特風(fēng)味和口感，并具有較高營養(yǎng)價(jià)值等而廣受大眾喜愛。但目前鲊?yán)苯返膫鹘y(tǒng)制作方法是自然發(fā)酵[1]，具有發(fā)酵條件穩(wěn)定性差，生產(chǎn)發(fā)酵周期長，產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定、安全性低，且沒有工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。因此，鲊?yán)苯芳兎N發(fā)酵技術(shù)則可以改善傳統(tǒng)發(fā)酵的很多弊端，使產(chǎn)品更安全[2]、更美味、更營養(yǎng)及生產(chǎn)更規(guī)?；?，品質(zhì)和產(chǎn)量均更符合人們的需求。在鲊?yán)苯芳兎N發(fā)酵的過程中，菌種的選擇、菌種的接種量、發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度、原料的配比等都是純菌接種快速發(fā)酵技術(shù)成功的關(guān)鍵[3-5]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠通過同型發(fā)酵或者異型發(fā)酵而產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌[6]，是蔬菜發(fā)酵中較為重要的一種細(xì)菌，最近有研究顯示乳酸菌還能夠加強(qiáng)特異性及非特異性免疫[7-8]，目前乳酸菌已廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵、工業(yè)乳酸發(fā)酵以及醫(yī)療保健領(lǐng)域[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，利用乳酸菌作為發(fā)酵菌，并采用響應(yīng)面法對其純種發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，旨在探討影響鲊?yán)苯芳兎N發(fā)酵的各因素，為鲊?yán)苯芳兎N發(fā)酵技術(shù)工業(yè)化提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅辣椒（紅線椒）、干玉米粉（過40目篩）、食鹽 重慶永輝超市；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum6001） 中國科學(xué)院菌種保藏中心。

氫氧化鈉（分析純） 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；甲醛、3,5-二硝基水楊酸、亞硝酸鈉等（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠；硝酸銀（分析純）天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂等（均為生物試劑） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；722-P可見分光光度計(jì) 上?，F(xiàn)科儀器有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；PB-10 Sartorius酸度計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵菌懸液的制備

發(fā)酵菌液的制備[10-11]：取乳酸菌保藏菌種2環(huán)于斜面（MRS培養(yǎng)基）活化48 h，再取2環(huán)于MRS液體培養(yǎng)基中再活化48 h后接入500 mL液體MRS培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)乳酸菌發(fā)酵液（冷藏保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3.2 純種發(fā)酵鲊?yán)苯返膯我蛩卦囼?yàn)

1.3.2.1 發(fā)酵溫度對鲊?yán)苯菲焚|(zhì)的影響研究

固定m（鲊?yán)苯罚胢（玉米粉）＝1∶1、食鹽添加量5%、菌懸液接種量5%，混合拌料后置于密閉的容器中分別在23、25、30、35、40、42℃條件下恒溫發(fā)酵5 d。然后測定成品的pH值、總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量和感官評分。

1.3.2.2 接種量對鲊?yán)苯菲焚|(zhì)的影響研究

將m（鲊?yán)苯罚胢（玉米粉）＝1∶1、發(fā)酵溫度30℃、食鹽添加量5%，混合拌料后置于密閉的容器中分別在1%、3%、5%、7%、9%、10%乳酸菌菌懸液接種量下恒溫發(fā)酵5 d。然后測定成品的pH值、總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量和感官評分。

1.3.2.3 發(fā)酵時(shí)間對鲊?yán)苯菲焚|(zhì)的影響研究

將m（鲊?yán)苯罚胢（玉米粉）＝1∶1、發(fā)酵溫度30℃、食鹽添加量和菌懸液接種量5%，混合拌料后置于密閉的容器中分別在發(fā)酵2、3、4、5、6、7 d。然后測定成品的pH值、總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量和感官評分。

1.3.2.4 原料配比對鲊?yán)苯菲焚|(zhì)的影響研究

將m（鲊?yán)苯罚胢（玉米粉）分別為3∶1、2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶2、1∶3，食鹽添加量5%，菌懸液接種量5%，發(fā)酵溫度30℃，混合拌料后置于密閉的容器中恒溫發(fā)酵5 d。然后測定成品的pH值、總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量和感官評分。

1.3.2.5 鹽添加量對鲊?yán)苯菲焚|(zhì)的影響研究

將m（鲊?yán)苯罚胢（玉米粉）＝1∶1、菌懸液接種量5%、發(fā)酵溫度30℃，混合拌料后置于密閉的容器中分別在1%、3%、5%、6%、8%、10%食鹽添加量下恒溫發(fā)酵5 d。然后測定成品的pH值、總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量和感官評分。

1.3.3 鲊?yán)苯芳兎N發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)研究

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)采用Design Expert 7.0.0軟件Box-Behnken中心組合原理進(jìn)行設(shè)計(jì)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間、m（鲊?yán)苯罚胢（玉米粉）以及食鹽添加量作為5個(gè)主要影響因素，以總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量、感官評分為相應(yīng)評價(jià)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)[12-14]，對鲊?yán)苯芳兎N發(fā)酵工藝條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)研究。

1.3.4 理化指標(biāo)的測定

pH值測定[15]：采用pH計(jì)測定；總酸含量測定[16]：中和滴定法；氨基酸態(tài)氮含量測定[17]：甲醛滴定法。

1.3.5 感官評價(jià)

采用100分制[18]，請10位有經(jīng)驗(yàn)的食品專家和10位消費(fèi)者（非專業(yè)人員）按感官評分標(biāo)準(zhǔn)對成熟鲊?yán)苯窐悠愤M(jìn)行評分，取平均分作為最終評分。

表1 鲊?yán)苯返母泄僭u定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of preserved pepper

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并采用OriginLab Origin Pro v7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對鲊?yán)苯钒l(fā)酵的影響

由表2可見，從23 ℃開始，隨著發(fā)酵溫度增加產(chǎn)酸量和氨基酸態(tài)氮含量都是先增加，35 ℃以后則開始減少，感官評分也表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢?？偹岷浚ㄒ匀樗嵊?jì)）在35 ℃時(shí)含量最高為1.07%，和30 ℃時(shí)的1.02%較接近，其他溫度下的總酸含量都＜0.81%?？梢?，溫度過低或過高均不利于鲊?yán)苯返娜樗嵝纬伞０被釕B(tài)氮的含量在30 ℃時(shí)最高為0.28%，同時(shí)，此時(shí)的感官評分也最高為91.42分。

表2 發(fā)酵溫度對鲊?yán)苯钒l(fā)酵的影響Table 2 Effect of fermentation temperature on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

2.1.2 接種量對鲊?yán)苯钒l(fā)酵的影響

表3 接種量對鲊?yán)苯钒l(fā)酵的影響Table 3 Effect of inoculum quantity on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

由表3可見，當(dāng)接種量從1%到10%遞增，pH值是逐漸降低的，較明顯變化的是1%、3%和5%。接種量＞5%后隨著接種量增加，pH值略降低，但是不顯著。鲊?yán)苯返目偹岷俊被釕B(tài)氮的含量也隨著接種量的增加而增加，當(dāng)接種量達(dá)到5%后，其增長量很小，甚至總酸的含量有略微下降的趨勢；這說明并不是接種量越多鲊?yán)苯钒l(fā)酵越好。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對鲊?yán)苯钒l(fā)酵的影響

表4 發(fā)酵時(shí)間對鲊?yán)苯钒l(fā)酵的影響Table 4 Effect of fermentation time on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

由表4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，鲊?yán)苯返陌被釕B(tài)氮含量、總酸含量逐漸升高、pH值逐漸下降；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到第4天時(shí)，鲊?yán)苯房偹岷繛?.09%，pH值為4.25，之后的鲊?yán)苯返目偹崃吭鲩L就十分緩慢并趨于平緩。發(fā)酵到第7天時(shí)，鲊?yán)苯返目偹岷亢蚿H值與第4天的變化仍不明顯。

2.1.4 原料配比對鲊?yán)苯菲焚|(zhì)的影響

表5 原料配比對鲊?yán)苯钒l(fā)酵的影響Table 5 Effect of mass ratio of chili pepper to corn flour on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

由表5可知，鲊?yán)苯匪嫉谋壤蕉?，發(fā)酵產(chǎn)酸量越多；當(dāng)鲊?yán)苯放c玉米質(zhì)量比達(dá)到3∶1時(shí)，總酸含量為1.67%，此時(shí)氨基酸態(tài)氮含量為0.20%，感官評分為80.79。雖然產(chǎn)酸較多，但是氨基酸態(tài)氮含量仍然較低；并且由于鲊?yán)苯繁壤?，水分過多，鲊?yán)苯返耐庥^和組織評分較低，以及過高的酸度，使之總體的感官評分較低。當(dāng)鲊?yán)苯放c玉米質(zhì)量比1∶3時(shí)，總酸含量0.49%、氨基酸態(tài)氮含量0.15%和感官評分80.46，此時(shí)的鲊?yán)苯犯鱾€(gè)指標(biāo)都處于較低的值，不易被消費(fèi)者接受。

2.1.5 食鹽添加量對鲊?yán)苯菲焚|(zhì)的影響

表6 食鹽添加量對鲊?yán)苯钒l(fā)酵的影響Table 6 Effect of salt content on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

由表6可知，隨著食鹽添加量的增加，pH值呈逐漸上升趨勢、同時(shí)總酸含量呈逐漸降低的趨勢。由于食鹽添加量越多，對發(fā)酵菌的抑制作用越強(qiáng)，故其發(fā)酵產(chǎn)酸則越少。當(dāng)食鹽添加量為1%時(shí)總酸含量為1.42%，但是感官評分為85.67則較低；此時(shí)的鹽添加量過少，鲊?yán)苯返南潭容^低，口感上能接受，但不是較適合的口感。當(dāng)食鹽添加量為3%和5%時(shí)，感官評分均較高為89.42和89.03，此時(shí)的鲊?yán)苯废潭日m合于人們咸度喜好程度；而之后的食鹽添加量為7%、8%和10%時(shí)的感官評分則更低。

2.2 鲊?yán)苯芳兎N發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert軟件采用Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型[19]。其試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方案選取見表7。

2.2.1 純種發(fā)酵條件對鲊?yán)苯房偹岷康挠绊?/p>

以鲊?yán)苯返目偹幔╕1）為響應(yīng)值，建立鲊?yán)苯钒l(fā)酵工藝參數(shù)回歸模型?；貧w方程為：

表8 總酸含量的回歸模型方差分析Table 8 Analysis of variance for the regression model for total acid content

對模型（1）進(jìn)行方差分析。由表8可知，F(xiàn)模型=21.01，P＜0.000 1，表明模型（1）極顯著，因變量與所考察自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.943 9），模型調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)=0.898 9，說明該模型能解釋90%以上響應(yīng)值的變化，失擬項(xiàng)P=0.052 4＞0.05為不顯著。離散系數(shù)表示實(shí)驗(yàn)的精確度，其值越小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性越高，本實(shí)驗(yàn)的離散系數(shù)為1.32%，在可接受范圍內(nèi)。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，模型（1）的一次項(xiàng)（P＜0.01）影響極顯著，二次項(xiàng)（P＜0.01）影響均極顯著。這都說明模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，該模型能夠反映響應(yīng)值的變化，即實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，可以用此模型鲊?yán)苯钒l(fā)酵的總酸含量進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.2.2 純種發(fā)酵條件對鲊?yán)苯钒被釕B(tài)氮含量的影響

以鲊?yán)苯钒l(fā)酵氨基酸態(tài)氮總量（Y2）為因變量，建立回歸模型?；貧w方程為：

表9 辣椒氨基酸態(tài)氮含量二次響應(yīng)模型方差分析Table 9 Analysis of variance for the quadratic response model for amino nitrogen content

以模型（2）回歸模型進(jìn)行方差分析。由表9可知，模型極顯著（P＜0.000 1），因變量與所考察自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.938 4），說明該模型能解釋93.84%響應(yīng)值的變化，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）。離散系數(shù)為6.82%，在可接受范圍內(nèi)。復(fù)相關(guān)系數(shù)越大，表明要變量之間的線性相關(guān)程度越密切，該模型的調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)（=0.889 2）接近1，說明變量間的線性相關(guān)程度密切。綜上所述，該試驗(yàn)結(jié)果可靠，本試驗(yàn)所得二次回歸方程能很好地對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測。

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，模型（2）的一次項(xiàng)X1、X2、X3、X4影響均極顯著（P＜0.01）；X5不顯著（P=0.710 9＞0.05）。對一次項(xiàng)回歸系數(shù)的絕對值大小進(jìn)行比較，從F值可以看出對鲊?yán)苯钒被釕B(tài)氮含量的影響作用的大小順序?yàn)椋篨1＞X2＞X4＞X3＞X5，即原料配比＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞食鹽添加量。

2.2.3 純種發(fā)酵條件對鲊?yán)苯犯泄僭u價(jià)的影響

以鲊?yán)苯钒l(fā)酵感官評分（Y3）為因變量，建立回歸模型?；貧w方程為：

以模型（3）進(jìn)行方差分析。由表10可知，模型（3）極顯著（P＜0.000 1），因變量與所考察自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.962 0），說明該模型能解釋96.20%響應(yīng)值的變化，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）。離散系數(shù)（1.45%）在可接受范圍內(nèi)。該模型的調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)（=0.931 6）接近1，則變量間的線性相關(guān)程度密切。這都說明試驗(yàn)結(jié)果可靠，本試驗(yàn)所得二次回歸方程能很好地對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測。

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，模型（3）的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)（P＜0.01）影響均極顯著；交互項(xiàng)（P＞0.05）影響均不顯著。對一次項(xiàng)回歸系數(shù)的絕對值大小進(jìn)行比較可知，對鲊?yán)苯钒被釕B(tài)氮含量的影響作用的大小順序?yàn)椋篨3＞X4＞X2＞X1＞X5，發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞原料配比＞食鹽添加量。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design Expert 7.0軟件處理后，優(yōu)化得到各個(gè)因素的最優(yōu)值分別為：m（鲊?yán)苯罚胢（玉米粉）＝1.02∶1、接種量5.37%、發(fā)酵溫度31.84 ℃、發(fā)酵時(shí)間4.26 d、食鹽添加量2.93%。為檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與真實(shí)情況的一致性，對上述優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：m（鲊?yán)苯罚胢（玉米粉）＝1∶1、接種量5.5%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時(shí)間4 d、食鹽添加量3.0%。在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)際值為：總酸含量（1.22±0.13）%、氨基酸態(tài)氮含量（0.281±0.041）%、感官評價(jià)（89.47±0.21）分。因此，該模型預(yù)測值與試驗(yàn)值之間的誤差在3%以內(nèi)，經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化所得的發(fā)酵最佳工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化鲊?yán)苯返募兎N發(fā)酵工藝條件，得出優(yōu)化工藝條件參數(shù)為：m（鲊?yán)苯罚胢（玉米粉）＝1∶1、接種量5.5%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時(shí)間4 d、食鹽添加量3.0%。在此條件下鲊?yán)苯犯泄僭u分、總酸含量和氨基酸態(tài)氮含量分別為89.47、1.22%和0.28%。在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)建立的二次線性回歸模型準(zhǔn)確有效，試驗(yàn)的擬合性較好。在此條件下，發(fā)酵所得鲊?yán)苯烦善飞珴甚r艷，微酸微辣，風(fēng)味濃郁。

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