唐亞梅，薛華麗，畢 陽，趙 瑩，沈科萍，王 毅

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

干腐病是我國西北地區(qū)馬鈴薯塊莖貯藏期的重要病害[1-5]，多種鐮刀菌（Fusariumspp.）與干腐病的發(fā)生相關(guān)，其中硫色鐮刀菌（F.sulphureum）是最重要的病原物[5]。該菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)生真菌毒素的能力，主要包括單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、串珠鐮刀菌素和伏馬菌素等[6-9]，這些毒素不但引起人畜急性中毒，還具有致癌、致畸、致突變等潛在危害[7,10-13]。環(huán)境條件對鐮刀菌的生長具有較大的影響，梨形鐮孢（F.poae）適宜相對干燥溫暖的環(huán)境，禾谷鐮孢（F.graminearum）在溫暖潮濕的環(huán)境中生長良好，而燕麥鐮孢（F.avenaceum）和黃色鐮孢（F.culmorum）則適宜涼爽和潮濕[15]。玉米串珠鐮孢（F.moniliform）在25℃和pH 5的Richard培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d產(chǎn)毒能力最強(qiáng)[14]；串珠鐮孢（F.moniliform）的最佳產(chǎn)毒條件為馬鈴薯＋葡萄糖培養(yǎng)液、pH 9、12 h光暗交替、25 ℃、培養(yǎng)10 d[15]；尖孢鐮孢（F.oxysporum）在25～30℃的PD培養(yǎng)液中培養(yǎng)15 d具有良好的產(chǎn)毒能力，光照和連續(xù)振蕩培養(yǎng)有利于產(chǎn)毒，但pH值對產(chǎn)毒影響不大[16]。進(jìn)一步的研究表明，27℃最有利于F.oxysporum產(chǎn)毒[17]。 但尚未見F.sulphureum產(chǎn)毒條件的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)基種類、pH值、培養(yǎng)方式、溫度和時間5種單因素篩選的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化F.sulphureum的最佳產(chǎn)毒條件，并對粗毒素的致病性進(jìn)行測定，旨在為F.sulphureum的毒素研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試馬鈴薯塊莖（品種：隴薯6號）2012年10月購于渭源縣會川甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地；F.sulphureum由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)所提供；綠豆種子購自華聯(lián)連鎖超市蘭州安寧店。

SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毒素濾液的制備

參照魏晉梅等[18]方法，將PDA上培養(yǎng)3～5 d的病菌接種于液體培養(yǎng)基中，在不同條件下培養(yǎng)，雙層滅菌紗布過濾，濾去菌絲體，即獲得具有毒素活性的培養(yǎng)濾液。

1.2.2 粗毒素濃縮液的制備

將最優(yōu)條件下所得培養(yǎng)濾液及對照旋轉(zhuǎn)蒸至2 mL，即得粗毒素濃縮液。

1.2.3 體外產(chǎn)毒條件的單因素篩選

參照柴兆祥等[19]方法，采用3個培養(yǎng)溫度（20、25、30 ℃）、3 個培養(yǎng)時間（7、10、17 d）、5 個pH值（3.0、4.5、6.0、7.0、8.0）、2 種培養(yǎng)方式（振蕩（90 r/min）與靜止）及3 種培養(yǎng)基（PSC、Richard、Czapack）研究對F.sulphureum體外產(chǎn)毒的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以綠豆種子胚根平均長度為響應(yīng)值，選擇對綠豆種子胚根抑制率有顯著影響的3個因素，以培養(yǎng)溫度（X1）、pH值（X2）和培養(yǎng)時間（X3）為自變量，以胚根平均長度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

1.3 毒素生物活性測定

1.3.1 濾液毒性測定

參照魏晉梅等[18]方法，用培養(yǎng)濾液對綠豆種子胚根長度的影響表示產(chǎn)毒情況。將大小均勻，顆粒飽滿的綠豆種子用2%次氯酸鈉溶液表面消毒5 min，無菌水沖洗3 次，放入鋪有滅菌濾紙、加入2 mL培養(yǎng)濾液和3 mL無菌水（稀釋度為1∶1.5）的培養(yǎng)皿內(nèi)，26～28 ℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)3 d后，測量胚根長度，計(jì)算平均值。每處理用種子20 粒，重復(fù)3 次。

1.3.2 粗毒素致病性測定

參照楊志敏等[5]方法，選擇大小均勻、無病蟲害、無損傷的馬鈴薯塊莖，清洗后用0.5%的次氯酸鈉溶液消毒20 min，沖洗后將馬鈴薯塊莖制作成1 cm×3.5 cm的切片，先用無菌水清洗，再用75%酒精擦洗并在酒精燈火焰上灼燒去除多余酒精，置于鋪有已滅菌的濕濾紙的培養(yǎng)皿（內(nèi)徑17 cm）上，黑暗恒溫恒濕培養(yǎng)2 h后，分別將0.5 mL培養(yǎng)濾液濃縮液、對照濾液、無菌水滴至切片中央，27 ℃恒溫培養(yǎng)4 d后采用El-Hassan等[20]方法調(diào)查發(fā)病率。每處理用切片8 片，重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

全部數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，并采用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著分析，利用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行方差分析和二次多項(xiàng)回歸擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種單因素對F.sulphureum體外產(chǎn)毒的影響

圖1 培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)時間（B）、pH值（C）、培養(yǎng)方式（D）和培養(yǎng)基（E）對綠豆胚根長度的影響Fig.1 Effects of temperature (A), time (B), pH (C), aeration (D) and medium (E) on the length of mung bean radicles

由圖1A可知，溫度對F.sulphureum的產(chǎn)毒具有顯著的影響，25 ℃培養(yǎng)濾液處理后的綠豆種子胚根長度分別是20 ℃和30 ℃濾液處理的79.63%、56.21%。由此表明，在20～30 ℃的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)，25 ℃最有利于F.sulphureum體外產(chǎn)毒。由圖1B可知，培養(yǎng)時間對F.sulphureumt體外產(chǎn)毒具有較大的影響，培養(yǎng)7～10 d時，毒素產(chǎn)量逐漸提高，第10天達(dá)到最大，綠豆種子胚根長度分別是7 d和17 d處理的67.75%和84.21%，但進(jìn)一步延長培養(yǎng)時間毒素產(chǎn)量反而降低。由圖1C可知，pH值對F.sulphureum體外產(chǎn)毒也具有明顯的影響，pH 4.5的培養(yǎng)濾液處理后的綠豆種子胚根長度僅分別是pH 3.0、6.0、7.0和8.0處理的65.10%、52.13%、51.50%和52.24%。由圖1D可知，培養(yǎng)方式對F.sulphureum產(chǎn)毒也有一定的影響，振蕩培養(yǎng)比靜止培養(yǎng)更有利于產(chǎn)毒，振蕩培養(yǎng)濾液對綠豆種子胚根生長的抑制效果比靜止培養(yǎng)高出近1倍。由圖1E可知，在供試的3種培養(yǎng)基中，Richard培養(yǎng)基最有利于F.sulphureum體外產(chǎn)毒，該濾液處理后的綠豆種子胚根長度僅分別是PSC和Czapack培養(yǎng)濾液處理的40.64%和43.88%。

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的確定

利用Design-Expert 7.0軟件對表1進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合試驗(yàn)和方差分析，反映培養(yǎng)溫度、pH值和培養(yǎng)時間對綠豆種子胚根平均長度的影響，擬合所得多元二次回歸方程如下：

該方程復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.973 2，響應(yīng)變量R2為0.938 8，因此，可以充分描述獨(dú)立變量對綠豆胚根平均長度的影響。該模型Prob＞F值為0.000 1，模型極顯著，模型擬合程度良好。

表1 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)分析結(jié)果Table 1 Results of Box-Behnken response surface design

2.2.2 回歸方程的方差分析

表2 回歸方程各項(xiàng)的方差分析Table 2 Variance analysis for each item of the regression equation

由表2可知，綠豆胚根長度方程的一次項(xiàng)（除X2外）和二次項(xiàng)極其顯著，說明各具體因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的一次線性關(guān)系。交互項(xiàng)X1X3顯著，因此說明X1和X3之間的交互作用很好，整個響應(yīng)面基于各因素間的交互作用構(gòu)成。另外，模型的變異系數(shù)為15.89%，證明回歸方程擬合程度較好，說明試驗(yàn)具有很高的可信性和準(zhǔn)確性。失擬項(xiàng)不顯著，因此說明實(shí)驗(yàn)的誤差很小。

2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)回歸方程預(yù)測3個因素對綠豆種子胚根長度的響應(yīng)曲面圖直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響（圖2）。由響應(yīng)曲面和等高線圖以及回歸方程分析可知，有利于F.sulphureum體外產(chǎn)毒的最佳條件為：溫度22.2℃、pH 5.1、時間12 d，按上述優(yōu)化條件培養(yǎng)的濾液對綠豆種子胚根的生長抑制良好。

圖2 培養(yǎng)溫度（X1）、pH值（X2）和培養(yǎng)時間（X3）對綠豆胚根平均長度影響的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface plots for the effects of temperature (X1), pH (X2)and time (X3) on the average length of mung bean seed radicles

2.3 粗毒素致病性驗(yàn)證

由圖3可知，粗毒素濃縮液對馬鈴薯塊莖切片的發(fā)病率、病斑直徑分別為37.50%和25.6 mm，而對照和無菌水處理者未見發(fā)病。由此表明，F(xiàn).sulphureum產(chǎn)生的粗毒素對馬鈴薯塊莖切片具有良好的致病力。

圖3 粗毒素對馬鈴薯切片的致病性Fig.3 Pathogenicity of crude toxin on potato tuber slices

3 討 論

本研究結(jié)果表明，溫度、時間、pH值、培養(yǎng)方式和培養(yǎng)基對F.sulphureum的產(chǎn)毒均有不同程度的影響。前期本課題組已證明單端孢霉烯族毒素是F.sulphureum最主要的代謝毒素并具有較強(qiáng)的致病能力。25℃最有利于產(chǎn)毒是因?yàn)樵擃惗舅氐纳锖铣墒堑湫偷纳^程[22]，溫度對酶活性有顯著影響，不同類型的酶均有其作用的最適溫度，低于該溫度酶的活性受到抑制，高于該溫度則使酶變性失活，均不利于產(chǎn)毒[23]。培養(yǎng)10 d最有利于產(chǎn)毒是因?yàn)樵擃惗舅氐姆e累在10 d達(dá)到最大，隨著培養(yǎng)時間的進(jìn)一步延長毒素含量減少，可能與毒素在該條件下自我降解有關(guān)[14]；此外，菌絲老化也會降低毒素的產(chǎn)量[15]。pH 4.5最有利于該菌生長繁殖，且產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素穩(wěn)定性良好[7]。振蕩培養(yǎng)有利于產(chǎn)毒是因?yàn)檎袷幱欣诘孜锘虼x產(chǎn)物更好的在體系內(nèi)轉(zhuǎn)移和發(fā)揮作用，使培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分有效地得到利用。此外，通過振蕩可以讓更多的氧氣溶解于培養(yǎng)液中，也更有利于菌體生長[24]。

種子的發(fā)芽抑制實(shí)驗(yàn)是檢測病原物粗毒素的常用生物學(xué)方法之一[25]，但單純通過單因素篩選，很難客觀地反映病原物產(chǎn)毒的最優(yōu)條件，由于不同的因素之間具有交互作用[26]。因此，采用響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)可較全面地反映病原菌產(chǎn)毒與環(huán)境條件間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)從培養(yǎng)基種類、pH值、溫度、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)時間等方面首次系統(tǒng)地研究了影響F.sulphureum體外產(chǎn)毒的因素，明確了該菌產(chǎn)生粗毒素的最優(yōu)條件，但對體外培養(yǎng)產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素的分離、純化和定性定量分析仍有待于進(jìn)一步研究。

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