裘雅漁, 李巧玲, 程和勇

(1. 浙江大學(xué) 化學(xué)系， 浙江 杭州 310027； 2. 杭州師范大學(xué) 材料系， 浙江 杭州 310058)

0 引 言

黃秋葵單糖是從黃秋葵粗多糖酸水解后得到單糖組分,而黃秋葵粗多糖又是從黃秋葵嫩莢果中提取的水溶性成分。藥理學(xué)研究表明,這種由水溶性纖維果膠、半乳聚糖和阿拉伯樹膠等組成的黃秋葵粗多糖，具有保護(hù)腸胃、肝臟和皮膚粘膜作用[1～3]，并能刺激中樞神經(jīng)，加速血液循環(huán)及促進(jìn)新陳代謝和全身血管活化[4]，可防治因血管供血不足造成的心臟病、中風(fēng)、骨質(zhì)疏松及老年癡呆等疾病[5]，因此對(duì)黃秋葵粗多糖的成分研究很有必要。由于粗多糖由各種基本的中性單糖組成的，因此對(duì)單糖組成測(cè)定是控制多糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和提供多糖基本信息的最重要環(huán)節(jié)之一[6-8]。而單糖存在互變異構(gòu)體、差向異構(gòu)體、結(jié)構(gòu)相似等特征[9]，且往往同一待測(cè)樣品，如多糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等可能含有許多類型的單糖[10-11]，所以單糖分析有其自身的特點(diǎn)，必須具有高效的分離技術(shù)，方可實(shí)現(xiàn)系列單糖的有效分離。羅利攀等用GC-MS方法[12]對(duì)不同產(chǎn)地的紅景天多糖進(jìn)行單糖組分分析，雖然MS檢測(cè)器靈敏度很高，但需要對(duì)單糖進(jìn)行衍生化處理，過程繁瑣且衍生化是否充分大大影響測(cè)定結(jié)果；王松柏等用毛細(xì)管電泳法[13]測(cè)定防風(fēng)粗多糖的單糖組分研究同樣存在柱前衍生的缺點(diǎn)；其他諸如用HPLC反相柱方法測(cè)定[14]絞股藍(lán)粗多糖的單糖組成存在分離度較差且流動(dòng)相需用到大量乙腈等有毒試劑的明顯缺點(diǎn)。

本研究采用高效液相滲透色譜方法，用示差折光質(zhì)量型檢測(cè)器和磺化的聚苯乙烯二乙烯基苯陽離子交換樹脂(Pb2+)柱(交聯(lián)度為6%)，用去離子水做流動(dòng)相建立適于黃秋葵多糖單糖組成測(cè)定的HPSEC新方法，達(dá)到靈敏度適宜、安全、快速、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)單和可在線大批量分析的目標(biāo)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

WATERS 2690液相色譜儀(美國WATERS 公司)；PRE-PACKED COLUMN RT POLYSPHER CH PB 分析糖柱(德國MERCK公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；EZ-DRY冷凍干燥機(jī)(美國Filter公司)。三氟乙酸(TFA，Merck公司)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑)；乙腈(TEDIA公司)；葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、木糖 (Xy1)、果糖(FRU)，丙三醇(Gly)均購自Sigma公司,其他試劑均為分析純。黃秋葵多糖由本教研室制備。

1.2 黃秋葵多糖水解

精確稱取黃秋葵多糖樣品20.0 mg于安瓿中，分別加入2 mol/L TFA、2 mol/L H2SO4以及其混酸溶液2.0 mL，充氮?dú)夥夤埽?10 ℃油浴分別水解2、4、6、8和10 h。冷卻至室溫，反應(yīng)混合物1 000 r/min離心5 min，取上清液用0.3 mol/L NaOH溶液中和到約pH 7.0。

1.3 HPLC分析方法

采用WATERS 2690色譜系統(tǒng),WATERS 2410 示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度40 ℃；柱溫80 ℃；色譜柱為Polyspher CH PB (7.8 mm× 300 mm,made in Germany)；流速0.6 mL/min；流動(dòng)相為去離子水；進(jìn)樣體積50 μL 。

1.4 分析原理與方法

1.4.1定量校正因子

以Gly(丙三醇)為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定7種單糖的定量較正因子(fVs)。精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)單糖,并配制成2 mmol/L的母液，用時(shí)稀釋為5個(gè)不同濃度的單糖溶液，并進(jìn)行HPLC分析 (線性范圍1～10 mmol)。

1.4.2相關(guān)系數(shù)與回歸方程

以單糖的濃度X(Wi/Ws)與峰面積Y(Ai/As)作圖，得回歸方程與相關(guān)系數(shù)。求出各單糖的斜率b，即定量較正因子,

f0fVs=(Wi/Ws)/(Ai/As)

式中，Ai、As分別為Gly(丙三醇)和標(biāo)準(zhǔn)單糖的HPLC峰面積。

1.4.3摩爾比的計(jì)算

以Gly為內(nèi)標(biāo)，得到各單糖的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積比，乘以f/m(m為單糖的相對(duì)分子質(zhì)量)，所得的值之比為摩爾比，即：

RVs=fVs(Ai/As)/m

2 結(jié)果與討論

2.1 單糖對(duì)照品的HPLC分離

為實(shí)現(xiàn)黃秋葵粗多糖各組成單糖的高效分離，本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃秋葵粗多糖可能包含的葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、木糖 (Xy1)、果糖(FRU))7種標(biāo)準(zhǔn)單糖及內(nèi)標(biāo)Gly的高效液相色譜分離條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在2.5 mmol/L 醋酸水溶液，5 mmol/L醋酸水溶液 和 去離子水三者之間選擇，去離子水中的分辨率高，分離效率最好，且樣品容量大，因此去離子水為分離此7種單糖的較理想色譜分離條件。色譜峰的各峰保留時(shí)間依次為內(nèi)標(biāo)Gly,葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、果糖(FRU)以及木糖 (Xy1)。其中，內(nèi)標(biāo)Gly與其他單糖有很好的分離，其作為內(nèi)標(biāo)是合適的。

2.2 多糖水解樣品制備條件優(yōu)化

多糖水解樣品的制備通常要經(jīng)復(fù)雜的干燥過程，方可進(jìn)行下一步的分析。本樣品制備方法省略干燥過程，而將多糖水解液直接用NaOH中和(約中性)，這對(duì)于發(fā)展多糖的定性定量在線分析技術(shù)有重要的實(shí)際意義。該制備方法的特點(diǎn)是：① 簡(jiǎn)化工藝，避免干燥損失。② 該多糖水解樣品制備過程對(duì)多糖的組成測(cè)定無影響。圖1是黃秋葵多糖經(jīng)TFA水解后，水解液經(jīng)傳統(tǒng)的干燥過程和未經(jīng)干燥過程的HPLC圖，圖中未發(fā)現(xiàn)有明顯吸收峰改變。③ 對(duì)多糖的含量、單糖組成等定量分析更有意義，因此過程幾乎無糖損失，多糖水解液可直接進(jìn)行在線大批量分析監(jiān)測(cè)。

2.3 黃秋葵多糖樣品的單糖組成分析

2.3.1多糖水解時(shí)間對(duì)分析結(jié)果的影響

考察了TFA的不同水解時(shí)間對(duì)黃秋葵多糖的組成測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果如圖2所示。黃秋葵多糖隨水解時(shí)間的延長，測(cè)定的單糖摩爾比率增加，而在110 ℃用2 mmol/L TFA水解8 h后，水解已完全。可見，黃秋葵多糖經(jīng)TFA水解8 h為其合適的水解時(shí)間。

(a) 干燥

(b) 無干燥

圖2 黃秋葵多糖經(jīng)TFA水解的時(shí)間對(duì)各組成單糖的測(cè)定影響

2.3.2不同酸水解對(duì)黃秋葵多糖的單糖組成測(cè)定的影響

選擇用于水解多糖的合適種類的酸對(duì)準(zhǔn)確測(cè)定單糖組成非常重要。本研究考察了常用的TFA、H2SO4及其混酸等不同酸水解方法對(duì)黃秋葵多糖的組成測(cè)定結(jié)果的影響(見圖3)。結(jié)果表明，TFA和H2SO4對(duì)黃秋葵多糖的水解效果無明顯影響，但TFA和H2SO4混酸水解該多糖時(shí)，單糖測(cè)定結(jié)果有一定的變化，其原因尚不清楚。所以，本實(shí)驗(yàn)選用TFA水解8 h為黃秋葵多糖的合適水解時(shí)間。

(a) 單糖標(biāo)準(zhǔn)品+丙三醇

(c) H2SO4

1-葡萄糖， 2-阿拉伯糖， 3-甘露糖， 4-半乳糖， 5-鼠李糖， 6-果糖， 7-木糖

圖3 黃秋葵多糖的不同酸水解樣品的色譜圖

2.3.3黃秋葵多糖的單糖組成測(cè)定結(jié)果

由HPSEC-RID分析和摩爾比計(jì)算結(jié)果可知，黃秋葵多糖由木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、半乳糖及阿拉伯糖7種單糖組成，其摩爾比為0.57∶1.00∶0.53∶3.50∶1.75∶1.25∶1.70，單糖測(cè)定的精密度(RSD，n=3)均低于4.5% ，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性良好(見表1)。

3 結(jié) 語

本研究通過凝膠滲透HPSEC法，實(shí)現(xiàn)在普通實(shí)驗(yàn)室常用示差折光檢測(cè)器和聚苯乙烯二乙烯基苯陽離子交換樹脂(Pb2+)糖柱分離分析黃秋葵多糖的單糖組成，并可望推廣用于其他多糖的單糖組成測(cè)定；同時(shí)，建立了黃秋葵多糖水解樣品的制備優(yōu)化工藝，避免了傳統(tǒng)多糖水解產(chǎn)物的復(fù)雜干燥過程和進(jìn)行繁瑣的衍生化反應(yīng)[15]；此外，該技術(shù)的完善，將在食品糖含量控制、大輸液葡萄糖監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，并為發(fā)展黃秋葵多糖以及其他多糖的在線定性定量HPSEC-RID方法奠定基礎(chǔ)。

表1 黃秋葵多糖的組成測(cè)定結(jié)果

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