孫 佳，邵榮花，高衛(wèi)真△

(1.天津泰達醫(yī)院藥劑科,天津 300457；2.天津醫(yī)科大學(xué),天津 300070)

半夏屬中藥的凝集素與其他屬性天南星科的中藥植物凝集素相同，均具有專一結(jié)合甘露糖的3個位點，并具有顯著的中藥抗蟲性[1]。本文參照已知半夏中凝集素的基因序列進行引物設(shè)計[2]，選擇PCR-RT法，自5種中藥半夏中分別克隆出凝集素的基因片段，并選擇相應(yīng)軟件對凝集素的基因片段分別給予分析，旨在研究半夏屬中藥凝集素的序列分析以及基因片段的克隆方法，為成功轉(zhuǎn)移到其他藥材植物中作準備，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

所選材料分別為三葉半夏、掌葉半夏、滴水珠半夏、石蜘蛛半夏和盾葉半夏。

1.2 方法

表1顯示，對半夏屬植物的總RNA進行提取，選擇某公司提供的提取試劑盒，參照試劑盒說明按步驟操作。選擇某公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑將cDNA的第一鏈合成。

表1 半夏RNA提取步驟

1.3 PCR-RT與引物的設(shè)計

參照掌葉半夏中藥凝集素的基因編碼中，其cDNA的序列信息對引物進行設(shè)計合成。其PCR的反應(yīng)體系是 PCR ×1buffer，每L含1.5 mmol的MgCl2，其酶為1U的Taq，其引物為每升0.25 μmol/L，其模板為每升100 ng的cDNA與0.2 mmol/L 的dNTP，總體積是25μL。其中PCR的擴增程序是60℃溫度下30 s退火，于94℃下30 s變性，72℃下1 min延伸，共完成循環(huán)35個，最后72℃溫度下10 min延伸，將PCR產(chǎn)物選擇1%的瓊脂糖應(yīng)用凝膠電泳給予檢測。

1.4 中藥凝集素的基因克隆與基因鑒定

將擴增產(chǎn)物應(yīng)用1%的瓊脂糖凝膠給予電泳并回收實施純化，同T-pMD19載體進行連接，直至轉(zhuǎn)化為感受態(tài)的DH5a當中，再將單菌落挑取，并接種于含有每升100 mg、LB聯(lián)合Amp的培養(yǎng)基中，保持37℃狀態(tài)下過夜培養(yǎng)。選擇載體通用的引物進行菌落的PCR檢測，最后對陽性轉(zhuǎn)化子進行測序。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

選擇Proteomics Ex2PASy Server軟件對蛋白質(zhì)的功能位點以及生化特性進行預(yù)測分析，選擇finder軟件查找DNA序列中的ORF，選擇Genescan軟件推定半夏氨基酸序列。

2 結(jié)果

2.1 rRNA18S與rRNA28S均顯示清晰條帶并能夠進行PCR-RT實驗

2.2 5種中藥半夏的序列堿基測得平均含量(表2)

表2 5種中藥半夏的堿基含量對照

2.3 基金片段編碼

表3顯示，基因片段的編碼分別為：三葉半夏170個氨基酸，掌葉半夏170個氨基酸，滴水珠半夏170個氨基酸，石蜘蛛半夏171個氨基酸，盾葉半夏107個氨基酸。并且所編碼的肽鏈中，均具有功能位點，如糖基化N位點、磷酸化蛋白激酶C位點和磷酸化酪蛋白激酶Ⅱ位點。因為編碼序列中突變的堿基因素，導(dǎo)致肽鏈氨基酸出現(xiàn)變化，因此具有多態(tài)性，且功能位點也存在差異。

表3 5種中藥半夏基因片段的蛋白預(yù)測對照

3 討論

半夏屬中藥植物主要為天南星科以及南星亞科，在全世界范圍內(nèi)約有7個品種，大多分布在中國，也可見于日本及韓國[3]。有文獻記載，目前我國共發(fā)現(xiàn)5個品種，主要為三葉半夏、掌葉半夏、盾葉半夏、石蜘蛛半夏和滴水珠半夏，且均為我國所特有的種類，其主要分布在我國東部以及東南部的各省[4]，而盾葉半夏目前已經(jīng)被列為罕見品種，達到瀕危級別。另據(jù)文獻報道，半夏屬植物全部具有藥用意義，屬于天然珍貴藥材[5]，并已延續(xù)應(yīng)用了2000多年，被中國藥典收載，不僅能夠燥濕化痰，而且可以降逆止嘔，同時還具有清痞散結(jié)等諸多治療功效，可緩解痰飲喘咳，改善胸脘痞悶，對患者惡心嘔吐以及眩暈之癥也有顯著效果[6]。三葉半夏活性蛋白還具有臨床抗腫瘤的功效，其中滴水珠半夏也可治療毒蛇咬傷等中毒病癥[7]。

由于半夏的凝集素具有與甘露糖中蛋白質(zhì)呈專一結(jié)合的屬性，并屬于中藥單子葉植物中甘露糖的凝集素家族，所以能夠表現(xiàn)出強效的抗蟲活性[8]。據(jù)文獻記載，于蓖麻籽的萃取物中，植物的凝集素被首先發(fā)現(xiàn)。另據(jù)研究顯示，中藥植物凝集素不僅含有單個或多個非催化性質(zhì)的蛋白，并能夠與單糖及多糖呈可逆性結(jié)合。中藥植物的生長發(fā)育中，可采取不同方式在各個階段有效避免病蟲的毒性侵犯，同時能夠抵御細菌與真菌，甚至病毒類病原體特異性的侵犯。據(jù)文獻報道，半夏凝集素不僅能夠凝集動物體內(nèi)的血紅細胞，同時能夠在生長比較旺盛的機體內(nèi)與肝癌細胞結(jié)合，導(dǎo)致其出現(xiàn)凝集，這也顯示出中藥在對肝癌進行治療上的研究前景。本文選擇Protein Predict 軟件分析半夏屬中5個中藥植物凝集素的基因片段，并分析編碼蛋白所在功能位點。經(jīng)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，中藥半夏均含有豐富的磷酸化位點，可以對酪蛋白激酶Ⅱ與蛋白激酶C進行磷酸化，這為今后的臨床治療以及臨床研究提供了重要的研究方向。

在對中藥三葉半夏與中藥石蜘蛛半夏凝集素的基因片段進行分析后發(fā)現(xiàn)，2種藥材編碼氨基酸的序列同中藥掌葉半夏的凝集素基因以及相應(yīng)的片段編碼中氨基酸的序列，全部含有與酪蛋白激酶Ⅱ相同的4個磷酸化位點，其中掌葉半夏與滴水珠半夏以及盾葉半夏均只含有與酪蛋白激酶Ⅱ相同的2個磷酸化位點，顯示2個位點缺失。同時，所得中藥氨基酸序列均含有蛋白激酶C的1個磷酸化位點，而三葉半夏以及石蜘蛛半夏和已知的掌葉半夏中，其凝集素的基因片段、氨基酸序列的編碼中，發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C的磷酸化位點與滴水珠半夏以及盾葉半夏中其蛋白激酶C的磷酸化位點也有所不同。在掌葉半夏的凝集素基因中，其編碼片段所屬的氨基酸序列中，共包括N-糖基化的3個功能位點，由于在214位原有的核苷酸C已突變呈T，導(dǎo)致編碼72位中的丙氨酸已變?yōu)槔i氨酸，并導(dǎo)致中藥三葉半夏以及石蜘蛛半夏中增加了N-糖基化的一個功能位點。由于核苷酸A于479位已突變呈G，導(dǎo)致核苷酸G于482位突變呈A，同時使得在酪氨酸Y于154位及甘氨酸G于155位上突變呈半胱氨酸C以及天冬氨酸D，進而三葉半夏以及石蜘蛛半夏均出現(xiàn)功能位點的缺失。上述基因的變異也預(yù)示著中藥半夏會更多地用于臨床治療，中藥將會在醫(yī)學(xué)界打開一個暫新的局面。

綜上所述，中藥半夏的凝集素基因能夠成功克隆，但是否能夠成功轉(zhuǎn)移到其他藥材植物當中，以此獲得新的抗蟲中藥植株和抗腫瘤中藥植株，還有待進行更深層次的研究。

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