楊琳芬 饒輝 符金華 趙薇娜

（農業(yè)部飼料質量監(jiān)督檢驗測試中心（南昌），江西 南昌 330029）

液相色譜—串聯質譜法測定豬配合飼料中吉他霉素

楊琳芬 饒輝 符金華 趙薇娜

（農業(yè)部飼料質量監(jiān)督檢驗測試中心（南昌），江西 南昌 330029）

采用液相色譜－串聯質譜儀測定豬配合飼料中吉他霉素。試樣中的吉他霉素經20/80（V/V）甲醇/水提取，取部分上清液稀釋，用美國waters公司生產的固相萃取柱（6cc/200mgOasisHLB）凈化，氮氣吹干，初始流動相復溶，上液相色譜－串聯質譜儀測定，保留時間和離子豐度比定性，外標法定量。本方法中吉他霉素檢測限為0.01mg/kg、定量限為0.05mg/ kg。吉他霉素的線性范圍為5～200ng/mL，相關系數r大于0.999。在0.05～50mg/kg的添加水平上，吉他霉素的平均回收率為63.3%～106.6%，相對標準偏差為1.6%～10.3%。

液相色譜—串聯質譜法；豬配合飼料；吉他霉素

吉他霉素對革蘭氏陽性菌和某些陰性菌、支原體、立克氏體、螺旋體等有效，主要用于抗青霉素的葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌感染。吉他霉素是豬配合飼料中常用的飼料藥物添加劑，防治慢性呼吸系統(tǒng)疾病，促進生豬的生長，提高生豬養(yǎng)殖效益。2001年農業(yè)部第168號公告《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》規(guī)定，豬配合飼料中吉他霉素添加量：用于促進生長，5～55mg/kg；用于防治疾病，80～330mg/kg，連用5～7d，休藥期7d。為了防止飼料生產企業(yè)和生豬養(yǎng)殖戶在豬配合飼料中超量添加，違法使用，開展豬配合飼料中吉他霉素的測定意義重大。

1 原理

飼料中的吉他霉素經甲醇水提取，OasisHLB純化，初始流動相復溶，過0.45μm濾膜，上液質測定，外標法確證及篩查。

2 樣品制備

按照GB/T20195制備試樣，磨碎，全部通過0.28 mm孔篩，混勻，裝入密閉容器中。

3 儀器設備

AB104-N電子天平、Agilent6410BQQQ液質聯用儀、HITACHICRG離心機。

4 操作步驟

4.1 試樣提取

精確稱取試樣2g于250mL錐形瓶中，準確加入20mL提取液（甲醇+水=20+80），振蕩30min，轉入離心管中，10000r/min離心5min，上清液備用。

4.2 樣品純化

固相萃取柱（6cc/200mgOasisHLB）分別用3 mL甲醇和3mL水活化，準確移取5mL上清液過柱，清洗1：3mL5%甲醇及2%乙酸；清洗2：3mL5%甲醇及2%氨水；清洗3：3mL65%甲醇及2%氨水，近干后用甲醇洗脫，收集洗脫液。在氮吹裝置上50℃下用氮氣吹干，準確加入1mL初始流動相（乙腈+0.1%甲酸水=90+10）復溶，過0.45μm微孔濾膜，上LC-MS/MS測定。上機液中的藥物濃度應稀釋在線性范圍內。

4.3 測定

4.3.1 液相色譜條件。色譜柱：AgilentZORBAXSBC182.1×100mm，1.8μm；柱溫：30℃；流動相：A：0.1%甲酸水溶液；B：0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫條件見表1。

4.3.2 質譜條件。離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測MRM。使用前，應調節(jié)各氣體流量，以使質譜靈敏度達到檢測要求。質譜參數應優(yōu)化至最佳。定性離子對、定量離子對及碰

撞能量的參考值見表2。

表1 流動相梯度洗脫條件min，%

表2 定性、定量離子對及碰撞能量的參考值m/z，V

4.3.3 定性測定。在相同試驗條件下，樣品中待測物的

保留時間與標準工作液的保留時間偏差在±2.5%之內，并且樣品圖譜中各組分定性離子的相對豐度與濃度接近標準工作液中對應的定性離子對的相對豐度進行比較，若偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應的待測物。

4.3.4 定量測定。按照上述液相色譜－串聯質譜條件測定樣品和標準工作溶液，以色譜峰面積進行單點或多點校正定量，樣品溶液中待測物的響應值應在儀器規(guī)定的線性范圍內。上述色譜和質譜條件下，對照品的工作曲線圖、對照品的色譜質譜圖和樣品的色譜質譜圖見圖1～3。

圖1 吉他霉素液質對照品的工作曲線圖

圖2 吉他霉素對照品的色譜質譜圖

圖3 吉他霉素樣品的色譜質譜圖

5 結果計算

試樣中某種待測物的含量X以質量分數（mg/ kg）表示，按式（1）計算。

式中：

m1—計算機外標法自動計算所得到的某待測物的質量，單位為微克（μg）；

m—試樣質量，單位為克（g）；

n—稀釋倍數。

測定結果用平行測定的算術平均值表示，結果保留三位有效數字。

6 重復性

同一分析者對同一試樣同時兩次平行測定結果的相對偏差不大于20%。

7 結果分析

采用液質聯用儀篩查確證豬配合飼料中吉他霉素等常用的飼料藥物添加劑，結果發(fā)現乳豬奶粉、乳豬人工乳、乳豬料、仔豬料和小豬料、中豬料、大豬料和生長育肥豬后期料均含有吉他霉素。樣品純化應采用美國waters公司生產的固相萃取柱（6cc/200mg OasisHLB），按優(yōu)化的OasisHLB程序進行純化，這樣提取的上機液純度高，基質干擾少。

1004-2342（2014）05-0013-02

S816.17

B

2014-07-31）