葉潔梅，吳 原，黃金山，李偲俊，韋 興，劉 云

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病。目前難治性癲癇的發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚，突觸重建是其重要的病理基礎(chǔ)之一[1]。研究表明，N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Vb(N-acetylglucosaminyltransferase Vb，GnT-Vb)和肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖(dystroglycan)是重要的神經(jīng)元表面受體，可與細(xì)胞外基質(zhì)成分如層黏連蛋白、纖維連接蛋白等結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞之間的黏附，參與細(xì)胞外環(huán)境信息交換，維持細(xì)胞骨架，影響神經(jīng)元極性，參與神經(jīng)突觸的形成及突觸后介質(zhì)的成熟等[2]。本研究擬觀察難治性癲癇細(xì)胞模型(Sombati癲癇細(xì)胞模型)中GnT-Vb和dystroglycan基因的表達(dá)變化，探討二者在癲癇形成過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新生24 h內(nèi)的SD乳鼠，SPF級(jí)，雌雄不限。(2)主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、NEUROBASAL Medium培養(yǎng)液、B27 Supplement(GIBICO)；Trizol、SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen公司)；SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司)。(3)主要儀器設(shè)備：熒光定量PCR儀(ABI7500 Fast)；熒光顯微鏡(Olympus公司)； 二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Thermo公司)等。

1.2 方法

1.2.1 原代海馬神經(jīng)元分離培養(yǎng)與鑒定 取新生24 h內(nèi)SD乳鼠，于75%乙醇中浸泡消毒。斷頭取腦，置于預(yù)冷的D-Hank′s液中。分離雙側(cè)海馬，剔除腦膜后剪碎組織，用0.125%胰蛋白酶于37 ℃的恒溫水浴箱消化15 min。小心吸出胰酶后，加入5 ml種植培養(yǎng)液終止消化。漂洗2次，巴氏滴管輕柔吹打20次，1 000 r/min離心5 min棄上清液，重懸于種植培養(yǎng)液中。以200目篩網(wǎng)過濾，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L。1.5 ml/孔移入經(jīng)0.1%多聚賴氨酸包被過的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h后，全量更換為無血清維持培養(yǎng)液2 ml繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長情況，每3 d半量換液1次。

種植培養(yǎng)液配制：90%DMEM/F12培養(yǎng)基，10%胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素。無血清維持培養(yǎng)液的組成：98%NEUROBASAL Medium培養(yǎng)液，2%B27 Supplement，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素。于第7天采用神經(jīng)微絲免疫組化染色鑒定神經(jīng)元(按說明書操作)，取純度≥95%的細(xì)胞用于后繼實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 Sombati癲癇細(xì)胞模型的構(gòu)建 將培養(yǎng)至第14天的海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組設(shè)6孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。對(duì)照組更換為正常細(xì)胞外液培養(yǎng)3 h后恢復(fù)無血清維持培養(yǎng)液培養(yǎng)，模型組則更換為低鎂細(xì)胞外液培養(yǎng)3 h后恢復(fù)無血清維持培養(yǎng)液培養(yǎng)。正常細(xì)胞外液(mmol/L)的配制：NaCl 145 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，HEPES緩沖液 10 mmol/L，CaCl22 mmol/L，葡萄糖 10 mmol/L，甘氨酸 0.002 mmol/L，MgCl21 mmol/L，溶解于1 000 ml三蒸水，調(diào)pH值至7.0～7.2，過濾除菌。低鎂細(xì)胞外液(mmol/L)的配制：NaCl 145 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，HEPES緩沖液10 mmol/L，CaCl22 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，甘氨酸0.002 mmol/L，溶解于1 000 ml三蒸水，調(diào)pH值至7.0～7.2，過濾除菌。

1.2.3 通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time qPCR)方法檢測Sombati癲癇細(xì)胞模型中GnT-Vb和dystroglycan基因表達(dá)。

1.2.3.1 細(xì)胞樣品總RNA的提取 每10 cm2細(xì)胞加入1 ml Trizol液，用槍頭吹吸混勻，盡量讓細(xì)胞全部裂解，室溫放置5 min，每管中各加入0.2 ml氯仿，蓋緊離心管，反復(fù)顛倒混勻15 s，12 000×g，4℃離心10 min，取上層水相于離心管中。每管中各加0.5 ml異丙醇，輕輕混勻，室溫放置10 min，12 000×g，4 ℃離心10 min，棄去上清液。每管中加入1 ml的75%乙醇輕輕洗滌沉淀，12 000×g，4 ℃離心10 min，小心棄去上清液。室溫干燥5～10 min，RNA溶于50～100 μl水中。

1.2.3.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA 按照SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書操作，取無RNA酶的eppendorf管，每個(gè)樣本加入如下組分(Mix ×1)：RNA 2 μl，5×VILO Reaction Mix 4 μl，10×SuperScript Enzyme Mix 2 μl，DEPC-treated water 12 μl，總體系20 μl。輕輕混勻后，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，85 ℃孵育5 min終止反應(yīng)。所得到的cDNA保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 Real-time qPCR檢測目的基因的表達(dá) 檢測細(xì)胞樣品中目的基因和內(nèi)參基因(GAPDH基因)的表達(dá)量。體系中各組分的體積如下：超純水5.7 μl，2×SYBR Green PCR Master Mix 7.5 μl，上游引物(10 μmol/L)0.15 μl，下游引物(10 μmol/L)0.15 μl，模板1.5 μl，總體系15 μl(見表1)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，40個(gè)循環(huán)；95 ℃變性15 s；60 ℃退火延伸60 s。根據(jù)qPCR反應(yīng)曲線得到各樣品目的基因和內(nèi)參基因的循環(huán)閾值(Ct值)，數(shù)據(jù)分析使用QIAGEN公司RT2 Profiler PCR Array Data Analysis系統(tǒng)。

表1 GnT-Vb和dystroglycan基因檢測用引物序列(5′-3′)

Table1 Primer sequences for the gene expression detection of GnT-Vb and dystroglycan

引物名稱引物序列5′-3′GAPDH 上游ATGATTCTACCCACGGCAAG 下游CTGGAAGATGGTGATGGGTTGnT-Vb 上游ACGCCTACATCCAACACCAG 下游AACGGAGCTGATGTTCTGGGdystroglycan 上游CTCGTCCTGCCTTCTCCAATG 下游CGTCATCCTCACTGCTCTTCTC

注：GAPDH =內(nèi)參，GnT-Vb=N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Vb，dystroglycan=肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖

2 結(jié)果

2.1 Sombati癲癇細(xì)胞造模后第1天GnT-Vb和dystroglycan基因表達(dá)變化 Sombati癲癇細(xì)胞造模后第1天，模型組GnT-Vb基因表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而兩組dystroglycan基因表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.2 Sombati癲癇細(xì)胞造模后第4天GnT-Vb和dystroglycan基因表達(dá)變化 Sombati癲癇細(xì)胞造模后第4天，模型組GnT-Vb、dystroglycan基因表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

3 討論

GnT-Vb和dystroglycan是重要的跨膜糖蛋白，兩者均廣泛表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，是連接細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架蛋白的重要分子結(jié)構(gòu)，影響神經(jīng)元的分化、遷移，在神經(jīng)生長發(fā)育過程中起重要作用。GnT-Vb和dystroglycan不僅參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和可塑性，而且與成熟神經(jīng)元的病理狀態(tài)密切相關(guān)。

癲癇的反復(fù)放電造成神經(jīng)突起-生長錐異常生長最終形成異常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，是癲癇難治性形成的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，Sombati癲癇細(xì)胞模型中層黏連蛋白、整合素呈高表達(dá)，經(jīng)低鎂細(xì)胞液處理72 h后Sombati癲癇細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為部分神經(jīng)元胞體相融合，神經(jīng)突起遷徙靠近，神經(jīng)元之間出現(xiàn)網(wǎng)格變化，異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成[3-4]。生長錐表面的整合素胞外段在層黏連蛋白等因子的作用下使生長錐黏附于細(xì)胞外基質(zhì)上，引起微絲和微管運(yùn)動(dòng)，啟動(dòng)胞內(nèi)各級(jí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，直接調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，最終引起神經(jīng)突起的生長、延伸和神經(jīng)纖維的發(fā)芽，提示層黏連蛋白-整合素跨膜系統(tǒng)是難治性癲癇形成異常網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵。Dystroglycan作為層黏連蛋白的重要受體之一，可參與神經(jīng)元的軸突靶向和髓鞘形成過程。Berti等[5]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)dystroglycan和整合素兩者同時(shí)缺失時(shí)，層黏連蛋白介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶p38磷酸化受抑制，提示dystroglycan和整合素兩者可能共同參與層黏連蛋白介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶p38磷酸化過程，影響神經(jīng)元的軸突靶向和髓鞘形成。Lee等[6]報(bào)道，神經(jīng)元表面的GnT-Vb可以通過影響整合素與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，進(jìn)而影響酪氨酸的磷酸化，參與激活胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞突起生長和突觸形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Sombati癲癇細(xì)胞造模后第4天，與正常海馬神經(jīng)元比較，其GnT-Vb、dystroglycan基因表達(dá)水平均增高，提示GnT-Vb和dystroglycan可能同時(shí)參與了難治性癲癇的形成過程。

Sombati癲癇細(xì)胞模型是一種研究癲癇發(fā)病機(jī)制的理想模型，在低鎂細(xì)胞外液的作用下可形成持續(xù)的反復(fù)自發(fā)性癲癇樣放電。馬美剛等[7]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)低鎂細(xì)胞外液處理3 h后的Sombati癲癇細(xì)胞在3、6、24 h乳酸脫氫酶(LDH)活性均較對(duì)照組明顯升高，并隨著時(shí)間的延長，LDH的釋放量呈逐漸上升趨勢，提示Sombati癲癇細(xì)胞存在早期損傷作用。趙文元等[8]研究同樣發(fā)現(xiàn)Sombati癲癇細(xì)胞在產(chǎn)生癲癇樣放電早期可引起可神經(jīng)元的壞死，于3～24 h內(nèi)明顯，其中6 h達(dá)最高峰，推測神經(jīng)元在低鎂狀態(tài)下早期持續(xù)激烈的癲癇樣放電可能引起線粒體通透性改變，神經(jīng)元內(nèi)ATP大量消耗，部分神經(jīng)元發(fā)生應(yīng)激損傷，甚至由于ATP 的耗竭引起急性神經(jīng)元壞死。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Sombati癲癇細(xì)胞產(chǎn)生癲癇樣放電后第1天，與正常海馬神經(jīng)細(xì)胞比較，其GnT-Vb表達(dá)水平降低，而dystroglycan基因表達(dá)水平無差異，可能是由于Sombati癲癇細(xì)胞早期產(chǎn)生持續(xù)劇烈的癲癇樣放電時(shí)引起神經(jīng)元急性氧化應(yīng)激、損傷，阻斷了各種活性因子往返轉(zhuǎn)運(yùn)，引起細(xì)胞營養(yǎng)與代謝紊亂，導(dǎo)致造模后早期神經(jīng)元內(nèi)某些功能蛋白合成的短暫的反應(yīng)性降低?？傊珿nT-Vb和dystroglycan基因在Sombati癲癇細(xì)胞模型中的表達(dá)呈現(xiàn)一定的動(dòng)態(tài)變化，隨著時(shí)間的延長，二者基因表達(dá)水平逐漸增高。提示GnT-Vb和dystroglycan基因可能參與了難治性癲癇的形成過程，尤其是細(xì)胞持續(xù)自發(fā)性放電后的后期異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重組過程。

表2 造模后第1天對(duì)照組和模型組GnT-Vb和dystroglycan基因表達(dá)水平比較(n=6)

Table2 Comparison of mRNA expression levels of GnT-Vb and dystroglycan between control group and experimental group on the first day after model establishment

組別GnT-VbAVGΔCt 2-ΔΔCt 倍數(shù)變化 t值 P值dystroglycanAVGΔCt 2-ΔΔCt 倍數(shù)變化 t值 P值對(duì)照組模型組6 29±0 037 12±0 140 0127520 0071720 56-10 3550 0003 84±0 063 97±0 080 0698490 0639420 92-2 2310 090

注：倍數(shù)變化為模型組2-ΔΔCt/對(duì)照組2-ΔΔCt

表3 造模后第4天對(duì)照組和模型組GnT-Vb和dystroglycan基因表達(dá)水平比較(n=6)

Table3 Comparison of mRNA expression levels of GnT-Vb and dystroglycan between control group and experimental group on the fourth day after model establishment

組別GnT-VbAVGΔCt 2-ΔΔCt 倍數(shù)變化 t值 P值dystroglycanAVGΔCt 2-ΔΔCt 倍數(shù)變化 t值 P值對(duì)照組模型組7 40±0 006 43±0 090 0059320 0116311 9618 6280 0003 80±0 053 30±0 090 0719050 1017581 428 8150 001

癲癇的形成過程是一個(gè)受多種因子共同參與的復(fù)雜過程，不僅涉及神經(jīng)元之間、神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，而且還涉及許多生物活性分子之間復(fù)雜的相互調(diào)控機(jī)制。GnT-Vb和dystroglycan可能同時(shí)參與了癲癇的形成過程，但仍需要更深入的研究以闡明GnT-Vb和dystroglycan相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其與整合素-層黏連蛋白跨膜系統(tǒng)的相互作用，從而進(jìn)一步闡明癲癇的形成機(jī)制，有可能為難治性癲癇的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

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