邵進(jìn)明雷戰(zhàn)霞王道平張明昶徐文芬麻秀萍*

（1貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴陽550002；2貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽550007）

清胃散不同湯劑和顆粒劑中丹皮酚的含量變化分析

邵進(jìn)明1雷戰(zhàn)霞1王道平2張明昶1徐文芬1麻秀萍1*

（1貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴陽550002；2貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽550007）

目的 考察丹皮酚在清胃散傳統(tǒng)湯劑與配方湯劑以及清胃散顆粒劑和配方顆粒劑中的含量變化。方法 采用高效液相色譜法測(cè)定清胃散中丹皮酚的含量和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析方中的揮發(fā)油成分。結(jié)果 丹皮酚在清胃散傳統(tǒng)湯劑與配方湯劑中的含量分別為0.12%、0.13%，而在合煎顆粒劑與分煎配方顆粒劑中均未檢測(cè)出，同時(shí)氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)其揮發(fā)油中丹皮酚的含量為88.7%。結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果可對(duì)復(fù)方清胃散在臨床上合理運(yùn)用提供參考。

丹皮酚；清胃散；揮發(fā)油；高效液相色譜法；牡丹皮

寵清胃散出自李東垣《蘭室秘藏》，具有清胃涼血之功效，主治胃火牙痛；臨床上是指口腔炎、牙周炎、三叉神經(jīng)痛等癥狀［1］，其有效成分為丹皮酚、阿魏酸、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿等。而丹皮酚具有揮發(fā)性，可隨水蒸氣餾出［2］。它可能在煎煮、減壓濃縮和干糙過程中隨水蒸汽蒸餾而出，而病人在服藥時(shí)是將中藥復(fù)方湯劑趁熱或放冷后喝下?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明丹皮酚具有非麻醉性鎮(zhèn)痛、抗高血壓、抗血栓形成、抗動(dòng)脈粥樣硬化和協(xié)同抗腫瘤等作用［3-5］。

本論文采用高效液相色譜法對(duì)清胃散不同湯劑和顆粒劑中丹皮酚進(jìn)行含量測(cè)定分析，同時(shí)用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析該處方中的揮發(fā)油成分以探討復(fù)方在煎煮、減壓濃縮和干糙過程中丹皮酚的含量變化。

1 處方、儀器與試藥

清胃散處方由黃連6g，當(dāng)歸6g，生地黃6g，牡丹皮9g，升麻9g組成，其中黃連為毛茛科黃連Coptischinensis Franch.根莖（四川），當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels根（甘肅），生地黃為玄參科生地Rehmannia glutinosa Libosch.塊根（河南），丹皮為毛茛科植物牡丹皮Paeouiasuffruicoat Andr．的干燥根皮（安徽），升麻為毛茛科Cimicifuga foetida L.根莖（貴州）。各藥材經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定符合2010版《中國藥典》收載標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)按照藥典方法測(cè)定牡丹皮中丹皮酚的含量為1.36%，符合藥典要求［6］。

LC-20AT型高效液相色譜儀、DAD檢測(cè)器（日本島津）；AG135型電子天平；CH-250型超聲波清洗機(jī)；揮發(fā)油提取器等，甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水；提取溶劑甲醇為分析純，水為蒸餾水。丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)：11802-200504）購于中國藥品生物制品檢定所。

2 HPLC方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品及樣品溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹皮酚對(duì)照品8.12mg，加甲醇定容至25mL。即得濃度為0.3248mg· mL-1的丹皮酚對(duì)照品溶液。

2.1.2 傳統(tǒng)湯劑的制備 按實(shí)驗(yàn)處方稱取藥材飲片（合計(jì)36g），加8.5倍水［7］，浸泡30 min，頭煎保持微沸20 min，倒出煎液；藥渣再加4.5倍量的水煎煮15min，倒出煎液，合并所有藥液，過濾并量好體積并用蒸餾水定容到500mL，密封待用。用0.45μm微孔濾膜過濾即得傳統(tǒng)湯劑樣品溶液，見表1。

2.1.3 配方湯劑的制備 分別稱取當(dāng)歸、生地、黃連各24g，升麻、牡丹皮各36g，按傳統(tǒng)湯劑煎煮法制備各單味藥材湯劑。并量好各單味藥材湯劑體積，按處方比例混合即得配方湯劑，量好體積并用蒸餾水定容到500mL，0.45μm微孔濾膜過濾即得傳統(tǒng)湯劑樣品溶液，見表1。

表1 傳統(tǒng)湯劑溶液與配方湯劑溶液的制備情況（mL）

2.1.4 合煎顆粒劑樣品溶液的制備 按實(shí)驗(yàn)處方稱取藥材并按清胃散傳統(tǒng)湯劑制備法得到合煎液，減壓濃縮回流至近干，真空減壓干燥即得處方顆粒劑，出膏率見表2。精密稱取顆粒劑0.5g，置50mL容量瓶中，用甲醇定容。搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.5 分煎配方顆粒劑樣品溶液的制備 分別稱取單味藥材，按合煎液制法，制備各單味藥材飲片顆粒，并計(jì)算干膏率，見表2。根據(jù)出膏率換算并稱取相當(dāng)于飲片合煎液組成藥材用量的各單味藥材配方顆粒，混勻，得處方配方顆粒劑。精密稱取配方顆粒劑0.5g置50mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

表2 清胃散顆粒劑與配方顆粒劑中單味藥的出膏率（%，mL）

2.2.5 陰性樣品溶液的制備 按實(shí)驗(yàn)處方稱取藥材飲片（除牡丹皮），并依照“2.1.2”項(xiàng)下制備即得丹皮酚陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件 采用Hypersil ODS2為色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-水（45∶55）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長274nm；柱溫25℃；流速：1.0 mL·min-1；理論板數(shù)按丹皮酚峰計(jì)算應(yīng)不低于5000；重復(fù)性RSD%＜2%。進(jìn)樣量均為20μL，其丹皮酚對(duì)照品溶液、清胃散傳統(tǒng)湯劑、配方湯劑及陰性樣品溶液見圖1。

圖1 丹皮酚色譜峰

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取1mL、3mL、4mL、5mL、6mL的0.3248mg·mL-1丹皮酚對(duì)照品溶液定容到25mL，分別進(jìn)樣20μL，以峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，作線性回歸方程得A＝6 ×106C＋38001，r＝0.9999，結(jié)果表明丹皮酚在0.2598μg到6.4960μg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別注入20μL清胃散傳統(tǒng)湯劑、配方湯劑、陰性樣品溶液及丹皮酚對(duì)照品溶液于高效液相色譜儀中，記錄色譜圖。結(jié)果表明傳統(tǒng)湯劑在與丹皮酚對(duì)照品保留時(shí)間相應(yīng)的位置有色譜峰，而陰性樣品溶液則無色譜峰。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取丹皮酚對(duì)照品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，在色譜條件下測(cè)定各峰面積，其RSD為1.29%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按實(shí)驗(yàn)處方稱取藥材飲片，并依照“2.1.2”項(xiàng)下制備，平行制備6份樣品溶液，同法測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算丹皮酚的含量，其RSD為0.85%，表明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一樣品供試液，每隔2h進(jìn)一次樣并測(cè)定丹皮酚含量，其RSD為1.81%，結(jié)果表明本試驗(yàn)方法在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的9份清胃散處方，按“2.1.2”項(xiàng)下制備，分別取10mL的溶液并加入樣品中丹皮酚總含量80%，100%，120%的對(duì)照品各3份，實(shí)驗(yàn)得到其平均回收率為99.74%，RSD＝1.13%，表明方法可，結(jié)果見表3。

表3 樣品回收率試驗(yàn)結(jié)果（mg，mL）

2.9 含量測(cè)定結(jié)果

2.9.1 清胃散傳統(tǒng)湯劑和配方湯劑中丹皮酚的含量測(cè)定精密吸取適量的清胃散傳統(tǒng)湯劑和配方湯劑溶液，在對(duì)應(yīng)的色譜條件下平行測(cè)定6次，其丹皮酚的含量分別為0.50%，0.53%；其轉(zhuǎn)移率分別為36.91%，38.71%。

2.9.2 清胃散顆粒劑和配方顆粒劑中丹皮酚的含量測(cè)定按上述湯劑樣品溶液的制備方法，在色譜條件下進(jìn)樣，在丹皮酚的對(duì)應(yīng)位置沒有色譜峰存在，表明清胃散顆粒劑和配方顆粒劑中丹皮酚沒有。

3 GC-MS方法與結(jié)果

3.1 處方揮發(fā)油成分的提取 精密稱取一付清胃散處方（合計(jì)36g），采用水蒸氣蒸餾法提取2次，每次2小時(shí)，合并兩次提取得到的揮發(fā)油，以正己烷萃取2次，分液得到揮發(fā)油提取液［8～10］。

3.2 色譜條件 HP6890／5975C氣相色譜儀，色譜柱為ZB-5MSI 5%Phenyl-95%DiMethylp-olysiloxane（30m×0.25mm×0.25μm）彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫45℃（保留2min），以4℃.mini-1升溫至240℃，保持2min；汽化室溫度250℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓7.62psi，載氣流量1.0mL·min-1；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲時(shí)間：1.5min。離子源為EI源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70eV；發(fā)射電流34.6μA；倍增器電壓1125V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍20～450amu。

3.3 測(cè)定結(jié)果 揮發(fā)油氣相色譜圖共有21個(gè)峰，見圖2；相應(yīng)質(zhì)譜圖經(jīng)Class-500色譜軟件及NIST質(zhì)譜譜庫進(jìn)行檢索并結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研，共鑒定了15個(gè)化合物如萘，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚，丁香油，丹皮酚，藁本內(nèi)酯，3-丁基苯酞，丁烯基苯酞，苯氧乙酸烯丙酯，異丙基聯(lián)苯，亞丁基二氫-苯并呋喃酮，1，2，3-三甲基-4-丙烯基萘，正十七烷，正十八烷，正二十烷，2，6-丁基-4-甲基-2，5-環(huán)己二烯-1-酮，其中丹皮酚含量最高，相對(duì)百分含量88.7%。

圖2 揮發(fā)油氣相色譜圖

4 討論

丹皮酚在清胃散傳統(tǒng)湯劑中的百分含量為0.50%，轉(zhuǎn)移率為36.91%；而在配方湯劑中的百分含量為0.53%，轉(zhuǎn)移率為38.71%。則兩者之間無明顯差異；而清胃散顆粒劑與配方顆粒劑中丹皮酚都沒有，說明丹皮酚在制備成顆粒劑的過程中，隨水蒸氣蒸餾而出。而用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)得清胃散中揮發(fā)油的組成和含量時(shí)，方中以丹皮酚最高，藁本內(nèi)酯次之。若以丹皮酚為主要有效成分作為藥效治理指標(biāo)時(shí)，則不宜制備為顆粒劑使用。同時(shí)在四個(gè)HPLC色譜圖的比較中發(fā)現(xiàn)，在顆粒劑的HPLC色譜圖中發(fā)現(xiàn)有微量成分發(fā)生了變化，具體情況還需要進(jìn)一步的研究。

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Content Change Analysis of Paeonolin Different Decoctions of Qingwei Power

Shao Jinming1Le Zhanxia1Wang Daoping2Zhang Mingchang1XU W enfen1M A Xiuping1?
（1 Guiyang college of traditional Chinese medicine，Guiyang，550002，China；2 The key laboratory of Chemistry for natural products of Guizhou province and Chinese academy of sciences，Guiyang，550007，China）

Objective To investigate the content change of paeonol in different decoctions of Qingwei Power．Methods Using HPLC determine the content of paeonol in the different decoctions of Qingwei San and GC－MS technical analysis of volatile oils prescription．Results The average content of paeonol in Qingwei Power traditional decoction and Recipe decoction were 0.12%，0.13%，but the Decoction particles and formulated granular decoction for Qingwei Power were not detected，while mass spectrometry technique to detect the paeonol of volatile oil was 88.7%．Conclusino The result of this experiment provided reference to clinic use in reason about Qingwei San．

Paeonol；Qingwei Power；Vlatile oil；HPLC；Moutan

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.05.099

1672-2779（2014）-05-0156-03

楊 杰 本文校對(duì)：彭小冰

2013-11-11）

*通訊作者