張曉菊，吳媛，蔣春燕，張超穎，蘭新財(cái)

(1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院;2.金大康動(dòng)物保健品有限公司浙江金華 321017)

目前養(yǎng)殖場(chǎng)集約化程度高，豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)發(fā)病率增高，是危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的最重要疾病之一。據(jù)報(bào)道，PRDC 發(fā)病率一般為5%～60%，發(fā)病豬死亡率為20%～90%［1］。高密度的飼養(yǎng)環(huán)境使豬體自身正氣不足，尤其是特異性抗病正氣不足，導(dǎo)致外感溫?zé)岵⌒俺颂摱?，侵入機(jī)體暫為伏邪。如遇氣候環(huán)境異常，具有非時(shí)令之寒熱潮濕，導(dǎo)致豬體正氣再衰，機(jī)體抗邪無(wú)力，則溫?zé)岵⌒坝鈺r(shí)而發(fā)，使肺氣升降失常而表現(xiàn)出咳喘、咽喉腫痛、黏膜發(fā)紺、痰濁滲出等臨診癥狀。因此，根據(jù)PRDC 的臨床癥狀、病變特征和病機(jī)，中獸醫(yī)辨證為肺經(jīng)溫(瘟)病范疇，其治療呼吸道病有四大法:清熱解毒、宣肺利咽、化濕消痰、益氣養(yǎng)陰。據(jù)此，課題組自擬了7 個(gè)中藥復(fù)方，建立以小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以篩選、驗(yàn)證這些中藥復(fù)方制劑止咳化痰的效果，為中藥制劑在防治PRDC 上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)小鼠200 只，6 周齡，體重18～20 g，雌雄各半，由金華市藥品檢驗(yàn)所提供【SCXK(浙)2010－0046】，實(shí)驗(yàn)在金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行【SYXK(浙)2010－0022】。

1.1.2 中藥制劑

選取具有清熱解毒、宣肺化痰、益氣養(yǎng)陰、利咽消腫的中藥原料(各味中藥均購(gòu)自金華市尖峰大藥房連鎖有限公司)，組成方1、方2、方3、方4、方5、方6 和方7 共七個(gè)復(fù)方。①方1 組:生石膏、知母、蘆根、石菖蒲、前胡、桔梗、麻黃、浙貝、枳殼、炙甘草、五味子;②方2 組:黃芩、炒梔子、蘆根、石菖蒲、桔梗、葶藶子、烏梅、瓜蔞仁、冬瓜子、炙甘草;③方3組:生石膏、知母、蘆根、桔梗、瓜蔞、貝母、大黃、芒硝、炙甘草;④方4 組:梔子、黃芩、金銀花、連翹、前胡、桑白皮、南沙參、麥門冬;⑤方5 組:射干、山豆根、瓜蔞、貝母、桑白皮、葶藶子、蘇子、五味子;⑥方6 組:射干、山豆根、黃芩、金銀花、魚腥草、麥門冬、太子參、五味子;⑦方7 組:生石膏、知母、玄參、梔子、黃芩、大黃、葶藶子、蘇子、炙甘草。各組中藥復(fù)方分別加10 倍蒸餾水浸泡半小時(shí)后，煎煮1 h，收取濾液，減壓濃縮至l g/mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 藥物

濃氨水(NH3)，分析純，浙江中星化工試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào):20110925;氯化銨，分析純，衢州巨化試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào):20111001。氫溴酸右美沙芬片，淄博萬(wàn)杰制藥有限公司，批號(hào):1201001。臨用前用蒸餾水配成所需濃度的混懸液。

1.1.4 儀器

721 型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司生產(chǎn)。分析天平，上海上天精密儀器有限公司生產(chǎn)。提取中藥的儀器:TC－15 套式恒溫器，海寧市新華醫(yī)療器械廠生產(chǎn);濃縮中藥用R－501 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 止咳實(shí)驗(yàn)(濃氨水引咳法［2］)

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分9 種處理，分別為空白對(duì)照處理(生理鹽水按每只0.2 mL 灌服)，陽(yáng)性處理(右美沙芬按0.1 g/kg 體重，每只0.2 mL 灌服)，七個(gè)不同復(fù)方的中藥處理(按0.1 g/kg 體重，每只0.2 mL灌服)。每個(gè)處理均設(shè)2 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)5 只小鼠(已預(yù)先剔除對(duì)濃氨水不敏感者)。

實(shí)驗(yàn)組上下午各灌胃給藥1 次，灌藥前4 h、灌藥后4 h 內(nèi)禁食不禁水，連續(xù)用藥7 d。末次給藥后1 h，分別將小鼠逐一置于倒置的500 mL 玻璃容器內(nèi)，將濃氨水0.2 mL 用注射器盡量均勻的噴灑在棉花團(tuán)上，蓋上器皿一定時(shí)間(約10 s)誘咳，觀察自蓋上器皿后開(kāi)始至小鼠出現(xiàn)咳嗽的潛伏期及5 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)(注:小鼠咳嗽的判斷以劇烈收縮腹肌并張嘴為準(zhǔn)，時(shí)可聞到輕微的咳嗽聲)。

1.2.2 化痰實(shí)驗(yàn)(氣管段酚紅法［3］)

除陽(yáng)性藥物用氯化銨按0.1 g/kg 體重，每只0.2 mL 灌服外，其余分組及處理方法同止咳實(shí)驗(yàn)。

末次給藥30 min 后ip 注射0.5%酚紅溶液0.5 mL，30 min 后處死小鼠，剝離氣管周圍組織，甲狀軟骨下緣及氣管分支處用小血管夾夾住氣管，然后剪下甲狀軟骨下至氣管分支處的一段氣管，將各氣管段放入預(yù)先盛有4 mL 5% NaHCO3溶液試管中靜置l h，然后于分光光度計(jì)546 nm 處測(cè)A 值，置4℃存放24 h 后，重測(cè)A 值，取二者平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酚紅曲線計(jì)算酚紅含量(μg/mL)。

標(biāo)準(zhǔn)酚紅曲線的繪制:分析天平準(zhǔn)確稱取0.01 g 酚紅，加5%碳酸氫鈉溶解，配成1 mL 含100 μg，然后順次稀釋成每毫升含酚紅0.1、0.3、0.5、0.7、1、3、5、10 μg，用分光光度計(jì)測(cè)A 值，以酚紅劑量為橫坐標(biāo)，A 值為縱坐標(biāo)，根據(jù)酚紅濃度和A 值計(jì)算出回歸方程，繪制酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。據(jù)所測(cè)的A值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出酚紅的排泌量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 止咳實(shí)驗(yàn)

各處理對(duì)小鼠止咳作用的影響見(jiàn)表1。如表1所示，方5 和方7 組的潛伏時(shí)間與右美沙芬組接近，但顯著高于對(duì)照和其他方劑組(P＜0.05);同時(shí)，方5 和方7 組的5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)與右美沙芬組接近，與方2、方3 組均顯著低于對(duì)照和其他方劑組(P＜0.05)。結(jié)果表明，方7 和方5 可延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期，減少5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)，具有明顯的止咳作用。

表1 各中藥復(fù)方對(duì)小鼠的止咳作用(±s ，n=10)Tab.1 Antitussive effect of each Chinese medicine compound on the mice

表1 各中藥復(fù)方對(duì)小鼠的止咳作用(±s ，n=10)Tab.1 Antitussive effect of each Chinese medicine compound on the mice

注:同一列中字母相同者為差異無(wú)顯著性(P ＞0.05)，字母不同者為差異有顯著性(P＜0.05)，下同。Note:The same letter in the same column indicates non－significant difference，P ＞0.05.Different letters indicate significant difference，P＜0.05.The same below.

組別Groups潛伏期時(shí)間/ s Incubation period 5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)/次Cough times in 5 min/n方1 組Group 19.357 ±1.77a84.57 ±6.65a方2 組Group 210.229 ±1.00a68.00 ±3.92c方3 組Group 38.029 ±0.60a77.86 ±2.94c方4 組Group 46.857 ±0.63a91.43 ±3.08a方5 組Group 531.629 ±1.71c25.57 ±1.65b方6 組Group 612.671 ±3.31a80.00 ±4.06a方7 組Group 735.614 ±2.38c23.29 ±2.37b右美沙芬組Dextromethorphan group31.029 ±2.76c22.14 ±1.26b生理鹽水組Physiological saline group7.586 ±0.95a91.71 ±2.10 a

2.2 化痰實(shí)驗(yàn)

各處理對(duì)小鼠氣管段酚紅分泌量影響的結(jié)果見(jiàn)表2，表2 中數(shù)據(jù)顯示，除方4 組外，其他中藥組和氯化銨組的氣管酚紅排泌量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，并且方7、方5 和氯化銨組小鼠的酚紅排泌量顯著低于其他處理組(P＜0.05)。表明，中藥復(fù)方1～3、5～7 均有明顯的化痰作用，方5、方7 的化痰作用更明顯。

表2 中藥復(fù)方對(duì)小鼠的化痰作用(±s，n=10)Tab.2 Expectorant effect of each Chinese medicine compound on the mice

表2 中藥復(fù)方對(duì)小鼠的化痰作用(±s，n=10)Tab.2 Expectorant effect of each Chinese medicine compound on the mice

注:同表1。Note:the same as table one.

組別Groups氣管酚紅的吸光度(546 nm 處)Tracheal phenol red absorbance氣管酚紅的排泌量/μg/mL Amount of tracheal phenol red excretion方1 組Group 10.2 ±0.02bc1.07 ±0.12bc方2 組Group 20.2 ±0.03bc0.89 ±0.08cd方3 組Group 30.17 ±0.02dc0.81 ±0.10d方4 組Group 40.28 ±0.02a1.59 ±0.06a方5 組Group 50.1 ±0.01e0.55 ±0.01e方6 組Group 60.2 ±0.03bc1.16 ±0.16b方7 組Group 70.1 ±0.01e0.53 ±0.01e氯化銨組Ammonium chloride group0.11 ±0.01e0.53 ±0.04e生理鹽水組Physiological saline group0.25 ±0.02ab1.42 ±0.09 a

3 討論

PRDC 的癥狀是咳嗽、咯痰、呼吸困難等，這些癥狀互為因果。積痰可引咳，可阻塞細(xì)支氣管而致呼吸困難，進(jìn)而造成繼發(fā)或混合感染。咳嗽、咯痰若不加以控制，會(huì)使疾病進(jìn)一步惡化。故對(duì)呼吸道疾病進(jìn)行對(duì)癥治療，對(duì)防止疾病發(fā)展、并發(fā)癥的發(fā)生和原發(fā)疾病的進(jìn)一步惡化具有重要的意義。

中藥的組方配伍是中獸醫(yī)常用的治法，用不同藥味進(jìn)行配伍或相同藥物、不同用量配伍成不同方劑是中藥復(fù)方發(fā)揮不同療效的“奧秘”，即中藥配比是復(fù)方總體效應(yīng)變化的核心，是復(fù)方功效的關(guān)鍵［4］。因此課題組對(duì)“清熱解毒、宣肺利咽、化濕祛痰、益氣養(yǎng)陰”類中藥進(jìn)行不同配伍，形成七個(gè)中藥復(fù)方，進(jìn)行止咳化痰的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以篩選、驗(yàn)證這些中藥復(fù)方制劑的臨床功效。

酚紅祛痰實(shí)驗(yàn)利用酚紅從氣管排泄的特點(diǎn)，在化痰藥的作用下，隨著支氣管分泌物的增加，由呼吸道黏膜排出的酚紅量也增加，用分光光度計(jì)測(cè)出酚紅的排泄量，就可得知藥物化痰作用的強(qiáng)弱。本研究結(jié)果顯示，方5、方7 能顯著抑制小鼠氨水刺激誘發(fā)的咳嗽和明顯促進(jìn)小鼠氣管酚紅的排泌量，提示該兩方可以作用于有關(guān)的化學(xué)器官，抑制支氣管黏膜對(duì)刺激的反應(yīng)性而表現(xiàn)出止咳作用;可通過(guò)增加呼吸道上皮的纖毛運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)支氣管腺體的分泌，使痰液稀釋、黏度下降，易于咳出而發(fā)揮化痰作用。

方5 中的山豆根、射干宣肺利咽化痰，清熱解毒;瓜蔞、貝母具有清熱解毒、宣肺利咽化痰之功;葶藶子、蘇子降氣止咳，利水祛痰。李國(guó)信等［5］的實(shí)驗(yàn)也表明射干提取物能明顯增加小鼠氣管酚紅排泌量。研究表明貝母具有止咳化痰、抗菌、抗炎作用，通過(guò)多層次、多環(huán)節(jié)、多途徑發(fā)揮綜合調(diào)控效應(yīng)，既能抑制致病因素，又能改善癥狀［6］。馮冰虹等［7］報(bào)道，桑白皮水煎劑氯仿萃取物對(duì)氨水所致小鼠咳嗽有鎮(zhèn)咳作用，能明顯延長(zhǎng)小鼠咳嗽出現(xiàn)的潛伏期和減少2 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，桑白皮丙酮提取物有明顯鎮(zhèn)咳和祛痰作用［8］。五味子揮發(fā)油具有鎮(zhèn)咳作用，五味子酸性成分具有祛痰作用，五味子多糖可顯著提高巨噬細(xì)胞功能，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，具有較好的增強(qiáng)免疫作用。五味子粗多糖、五味子水煎劑具有升高白細(xì)胞及增強(qiáng)免疫功能的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用于急慢性肺部疾病等都具有良好作用［9］。

方7 中石膏、知母、梔子、黃芩、大黃清瀉肺火;知母、玄參具有涼血滋陰利咽;炙甘草益氣止咳化痰?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芩具有明顯舒張支氣管，改善氣道痙攣?zhàn)饔茫?0］。趙鐵華等［11］證實(shí)黃芩對(duì)金葡菌、肺炎鏈球菌、甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌等有明顯的抗菌活性。因此認(rèn)為黃芩總黃酮可用于細(xì)菌引起的上呼吸道感染疾病的預(yù)防和治療。玄參具有解熱、抗菌、抗炎等藥理作用。

因而綜觀方5、方7 全方，功補(bǔ)兼施，標(biāo)本兼治，既能化痰止咳，又能宣肺利咽，提高免疫功能，故能延長(zhǎng)小鼠的咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，并能增加小鼠氣管對(duì)酚紅的排泌量，即有祛痰作用。但方5、方7 的配伍作用機(jī)制及其止咳化痰作用機(jī)制需做進(jìn)一步的研究。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，方5、方7 對(duì)小鼠氨水引咳模型有明顯的抑制作用，并能明顯增加小鼠氣管對(duì)酚紅的排泌量，顯示有較好的化痰作用，為其臨床應(yīng)用提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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