程 倩，陳夢(mèng)竹，羅 麗，邵世光，唐 萍，鄭 霞，沈 潔

（連云港師范高等?？茖W(xué)校 生命科學(xué)系,江蘇 連云港 222000）

蜈蚣蘭無(wú)菌繁殖系的建立

程 倩，陳夢(mèng)竹，羅 麗，邵世光，唐 萍，鄭 霞，沈 潔

（連云港師范高等?？茖W(xué)校 生命科學(xué)系,江蘇 連云港 222000）

以蜈蚣蘭莖段為外植體,以0.1%HgCl2溶液為外植體表面消毒劑,通過6,8,10和12 min等4個(gè)外植體表面消毒時(shí)間處理比較,研究對(duì)外植體污染率、死亡率和側(cè)芽誘導(dǎo)率的影響,確定最佳消毒時(shí)間。結(jié)果表明,0.1%HgCl2溶液外植體表面消毒10 min效果最好,依此建立蜈蚣蘭無(wú)菌繁殖系。

蜈蚣蘭；外植體；表面消毒時(shí)間；無(wú)菌繁殖系

蜈蚣蘭（Cleiso-stama scolopendrifolium（Makino）Garay）為蘭科隔距蘭屬多年生常綠草本植物,附生于巖石或樹皮上,是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄中的Ⅱ級(jí)保護(hù)植物。全草入藥,有清熱解毒、潤(rùn)肺止血之功效,用于氣管炎、咳血、膽囊炎、咽喉炎等癥［1］。因其分布區(qū)域窄、生境獨(dú)特、種群小等原因,對(duì)其藥理、藥化方面的研究少有報(bào)道,其藥用僅限于少數(shù)地區(qū)的民間,影響了該物種資源的開發(fā)和利用［2］。組織培養(yǎng)技術(shù)為珍稀藥用植物種質(zhì)資源的保存、開發(fā)開辟了新途徑［3-6］。蜈蚣蘭的離體快繁目前尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以蜈蚣蘭的莖段為外植體,擬建立蜈蚣蘭無(wú)菌繁殖體系,為蜈蚣蘭的組織培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

l.l 材料

蜈蚣蘭于2012年5月采自江蘇省云臺(tái)山,采集和鑒定均由連云港師范高等?？茖W(xué)校完成。以蜈蚣蘭幼嫩植株為試驗(yàn)材料。

l.2 方法

1.2.1 外植體的處理和培養(yǎng)

將去除氣生根的蜈蚣蘭植株,用毛刷蘸洗滌劑進(jìn)行表面刷洗,在自來(lái)水下沖凈洗滌劑,至干凈的燒杯中流水沖洗2 h后,移至超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面消毒,以0.1%HgCl2溶液作為表面消毒劑。先將試驗(yàn)材料放入70%酒精中浸潤(rùn)30 s,然后迅速轉(zhuǎn)入0.1%HgCl2溶液中浸泡消毒。試驗(yàn)設(shè)6,8, 10和12 min等4個(gè)消毒處理時(shí)間。表面消毒后,用無(wú)菌水沖洗5遍,每遍不少于3 min。試材表面水分用無(wú)菌紙吸干后,將其剪切成2～3 cm長(zhǎng)的蜈蚣蘭莖段,接種于1/2MS+2.0 mg·L-16-BA+ 0.6%瓊脂+2%蔗糖的培養(yǎng)基中 （pH值5.8）。每瓶培養(yǎng)基只接種1個(gè)外植體。每處理接種20瓶,重復(fù)3次。培養(yǎng)條件：溫度 （25±2）℃,光照強(qiáng)度2 500 lx,光照時(shí)間12 h·d-1。每天觀察記錄外植體的生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

污染率/%=污染數(shù)/接種數(shù)×100,死亡率/%=死亡數(shù)/接種數(shù)×100（污染且死亡的統(tǒng)計(jì)在污染數(shù)里）,側(cè)芽誘導(dǎo)率/%=側(cè)芽萌動(dòng)數(shù)/接種數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

接種2周內(nèi),每日觀察外植體的生長(zhǎng)狀況,并記錄外植體污染和死亡情況；2周后統(tǒng)計(jì)污染率和死亡率,培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)外植體側(cè)芽誘導(dǎo)率。

表1顯示,隨著外植體表面消毒時(shí)間的延長(zhǎng),外植體污染率明顯降低,且10 m in的消毒時(shí)間處理效果顯著,外植體的污染率由75%降至35%；但同時(shí),外植體的死亡率隨消毒時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),12 min消毒時(shí)間處理使得外植體死亡率高達(dá)46.7%。上述數(shù)據(jù)表明,0.1%HgCl2表面消毒效果良好,但超出一定消毒時(shí)間后,對(duì)外植體影響較大。在本試驗(yàn)中,0.1%HgCl2表面消毒10 min效果最好。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)外植體消毒效果的影響

從表2可知,12 min消毒時(shí)間處理的外植體側(cè)芽誘導(dǎo)率最低,僅13.3%,且外植體葉片泛黃,甚至脫落。8 m in處理的外植體側(cè)芽誘導(dǎo)率最高,達(dá)18.3%,然其外植體的生長(zhǎng)狀況卻不及10 min消毒時(shí)間處理的外植體。

表2 不同消毒時(shí)間對(duì)外植體側(cè)芽誘導(dǎo)的影響

獲得蜈蚣蘭無(wú)菌繁殖系見圖1-2。

圖1 外植體側(cè)芽萌發(fā)

圖2 蜈蚣蘭無(wú)菌繁殖系

3 小結(jié)與討論

利用組織培養(yǎng)的方法可實(shí)現(xiàn)蜈蚣蘭的快速繁殖,為珍稀藥用植物的保護(hù)和合理利用奠定基礎(chǔ)。而無(wú)菌繁殖體系的建立是實(shí)現(xiàn)組培快繁的關(guān)鍵。在無(wú)菌繁殖體系建立過程中,選擇外植體表面消毒劑和確立消毒時(shí)間是首要環(huán)節(jié)。試驗(yàn)選用 0.1% HgCl2溶液作為外植體唯一表面消毒劑的原因有2個(gè)。一是其消毒效果好。0.1%HgCl2溶液的Hg2+可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合,使菌體蛋白變性、酶失活,從而有效清除附著在外植體表面的細(xì)菌及真菌。二是外植體形態(tài)特征較特殊,蜈蚣蘭植株微小,莖匍匐,節(jié)間距短,氣生根發(fā)達(dá),這些特征都會(huì)影響消毒劑的消毒效果。試驗(yàn)中外植體表面消毒時(shí)間的確定是通過比較6,8,10和12 m in等4個(gè)外植體表面消毒時(shí)間處理的外植體污染率、死亡率和側(cè)芽誘導(dǎo)率來(lái)完成的。結(jié)果表明,以 0.1% HgCl2為蜈蚣蘭外植體表面消毒劑消毒10 min,不僅外植體消毒效果好,外植體側(cè)芽萌發(fā)率高,且外植體生長(zhǎng)健壯。由此成功獲得蜈蚣蘭無(wú)菌繁殖系。而此物種的組培研究之前尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)中共設(shè)立了4個(gè)消毒時(shí)間處理,接種240個(gè)蜈蚣蘭外植體。接種至50 d時(shí),無(wú)1例細(xì)菌污染,出現(xiàn)的均為真菌污染,且污染瓶中菌絲相同。初步判斷為蜈蚣蘭內(nèi)生菌,現(xiàn)菌種已被分離純化,鑒定后將另外發(fā)表。因菌絲生長(zhǎng)迅速,嚴(yán)重影響了試驗(yàn)的進(jìn)程,在以后的蜈蚣蘭組培試驗(yàn)中,將重點(diǎn)尋求適宜的控制蜈蚣蘭內(nèi)生菌生長(zhǎng)的方法。另試驗(yàn)中,240個(gè)外植體接種的培養(yǎng)基配方一致,均為1/2MS+2.0 mg·L-16-BA+0.6%瓊脂+2%蔗糖,側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基以及壯苗生根培養(yǎng)基的配方還有待進(jìn)一步優(yōu)化,以篩選出最佳培養(yǎng)基。

［1］ 《全國(guó)中草藥匯編》編寫組.全國(guó)中草藥匯編 （下）［G］.北京：人民衛(wèi)生出版社,1978：656.

［2］ 張雷,馬波,邵世光.蜈蚣蘭藥用價(jià)值及生態(tài)學(xué)特性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39（26）：15960-15961.

［3］ 李春斌,方宏筠,王光林.藥用植物莪術(shù)的組織培養(yǎng)快速繁殖與植株再生的研究 ［J］.中草藥,2000,31（11）：853-856.

［4］ 范俊安,王繼生,張艷,等.鐵皮石斛組培品與野生品的形態(tài)組織學(xué)和多糖含量比較研究 ［J］.中國(guó)中藥雜志, 2005,30（21）：1648-1650.

［5］ 戴傳超,余伯陽(yáng),董晨,等.藥用植物大戟的快速繁殖研究 ［J］.廣西植物,2005,25（2）：152-155.

［6］ 張延紅,何春雨,劉曉博,等.甘肅道地黃芪種苗的離體快繁研究 ［J］.中草藥,2008,39（11）：1729-1732.

（責(zé)任編輯：張瑞麟）

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：0528-9017（2014）04-0515-02

文獻(xiàn)著錄格式：程倩,陳夢(mèng)竹,羅麗,等.蜈蚣蘭無(wú)菌繁殖系的建立 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（4）：515-516.

2013-12-06

江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 （2012JSSPITP4290）

程 倩 （1990-）,女,江蘇徐州人,生物制藥專業(yè)?？茖W(xué)生。

沈 潔 （1969-）,女,江蘇靖江人,理學(xué)碩士,教授,從事植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)與分子生物學(xué)教學(xué)與研究工作。E-mail：shenjie1969 @126.com。