孫威，封瑞，2，郭鳳，2，趙金生，2，趙美瞇，2，高青華，2，王紅梅 ，毛楠，郝麗英，2

（中國醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室；2.心血管研究所，沈陽 110001）

PreIQ及其突變體載體構(gòu)建表達(dá)純化和活性鑒定

孫威1，封瑞1，2，郭鳳1，2，趙金生1，2，趙美瞇1，2，高青華1，2，王紅梅1，毛楠1，郝麗英1，2

（中國醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室；2.心血管研究所，沈陽 110001）

目的構(gòu)建心肌L型鈣通道片段PreIQ及其突變體與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）重組的融合蛋白原核表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)純化和活性鑒定。方法 將PreIQ及其突變體的cDNA插入pGEX?6p?1質(zhì)粒載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，大量培養(yǎng)并利用異丙基硫代?β?D半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)PreIQ及其突變體的GST融合蛋白表達(dá)，GS?4Bbeads進(jìn)行分離純化。采用SDS?PAGE鑒定目的蛋白分子質(zhì)量和相對純度。采用Bradford方法測定純化后蛋白濃度。采用pull?down法檢測純化后蛋白的活性。結(jié)果 PreIQ及其突變體融合蛋白得到了大量表達(dá)；純化的PreIQ及其突變體具有較高的純度；純化后蛋白能與鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合，具有生物活性。結(jié)論 本研究成功構(gòu)建了PreIQ及其突變體融合蛋白原核表達(dá)載體，獲得具有生物活性的PreIQ及其突變體融合蛋白，為深入研究PreIQ的生能學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

融合蛋白；PreIQ；突變體；pull?down

鈣離子參與多種生理過程，如鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、肌肉興奮收縮［1］、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、細(xì)胞生長增值、心臟傳導(dǎo)、基因表達(dá)和激素分泌等。鈣通道廣泛存在于機(jī)體的各種類型細(xì)胞中，并且在不同的組織細(xì)胞，或同一組織細(xì)胞不同部位其鈣通道的類型也各不相同。根據(jù)鈣通道開閉的因素，將鈣通道分為5類，其中一大類為電壓依賴型鈣通道（voltage?depen?dent calcium channel，VDCC）。按照激活閾值的高低又分為高電壓激活鈣通道（high?voltage activated Ca2+channel，HVACa2+通道）和低電壓激活鈣通道（low?voltage activated Ca2+channel，LVACa2+通道），其中高電壓激活鈣通道包括L、N、P/Q及R型鈣通道。其膜電位低，激活前膜需要去極化。本文構(gòu)建的preIQ及其突變體融合蛋白即屬于L型高電壓激活鈣通道。

鈣通道是由α1亞單位和α2/δ、β、γ幾個輔助亞單位構(gòu)成的復(fù)合體［2］，由多基因編碼。不同類型鈣通道α1亞單位的編碼基因多有不同，其中，L型鈣通道結(jié)構(gòu)為α1C、α1D和α1S。α1亞單位在細(xì)胞膜上形成4個跨膜區(qū)域（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）。每個跨膜區(qū)域有6個螺旋肽段（S1～S6）及其間的連接肽鏈組成。α1C的羧基末端在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，自動調(diào)節(jié)Cav1.2的轉(zhuǎn)錄［3］。本文中合成的PreIQ融合蛋白正是L型鈣通道α1C亞基羧基末端的的一段蛋白，氨基酸序列為1599?1639，見圖1。

圖1 Cavl.2的結(jié)構(gòu)示意圖以及PrelQ及其突變體的氨基酸序列Fig.1 Schematic illustrations of the peptides of Cavl.2and Sequences of PrelQand its mutant

近年來人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞受到某種刺激后，L型鈣通道開放，增加的鈣離子對L型鈣通道能產(chǎn)生兩個互為相反的自身反饋調(diào)節(jié)，即鈣依賴性失活和激活。鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）作為一種鈣離子敏感器，能與L型鈣通道上的PreIQ結(jié)合，在上述過程中發(fā)揮重要作用。為了更好的研究細(xì)胞內(nèi)因子CaM是如何與PreIQ作用的，影響二者作用的因素有哪些，我們急需構(gòu)建PreIQ及其突變體的融合蛋白，提純這種蛋白單體用到后續(xù)的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中。故本文主要講述如何構(gòu)建L型鈣通道上PreIQ及其突變體融合蛋白質(zhì)粒，如何表達(dá)純化這種蛋白單體，并用實(shí)驗(yàn)證明提純后蛋白單體具有生物學(xué)活性。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX?6p?1/PreIQ和pGEX?6p?1/PreIQ突變體（圖1）質(zhì)粒由上海生工生物工程股份有限公司合成；異丙基硫代?β?D半乳糖苷（isopropyl thiogalacto?side，IPTG）、溶菌酶（lysozyme，LYS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、N?十二烷基肌氨酸鈉（N?lauryl sarcosine，N?Lau）、氨芐西林（ampicillin，Amp）均購自Sigma公司；PreScission Protease和GS?4Bbeads購自GEHealthcare公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)XOID公司；其他試劑均購自BIOSHARP公司。

1.2 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化和提取

1.2.1 BL21感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

應(yīng)用42℃精確熱激法進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。精確量取pGEX?6p?1/PreIQ質(zhì)粒10ng，加入E.coliBL21100μL，2mL離心管中輕輕混勻，冰浴30min，42℃水浴60s，快速轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2min。加入無菌SOC培養(yǎng)基1mL（胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 8.5mmol/L，KCl 2.5mmol/L，MgCl210mmol/L，葡萄糖20mmol/L），混勻置37℃水浴振蕩器中培養(yǎng)1h，轉(zhuǎn)速為120r/min。4000r/min離心2min，去除部分上清，懸浮沉淀的菌體約200μL加在含Amp 0.1g/L的LB固體瓊脂培養(yǎng)板上，無菌條件下涂抹均勻。待培養(yǎng)板將懸浮菌液吸收后，轉(zhuǎn)移至電熱恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)12～16h。1.2.2 質(zhì)粒提取

經(jīng)含AMP0.1g/L的瓊脂平板篩選后，取單克隆菌種接種于裝有含AMP0.1g/L的LB培養(yǎng)液3mL離心管中，37℃、120r/min培養(yǎng)12～16h。取菌液1mL（其余的菌液按菌液：50%甘油比例為4∶1凍存于-80℃冰箱中），15000r/min，4℃離心10min，棄上清；加冰預(yù)冷的堿裂解液Ⅰ250μL，劇烈渦旋使分散均勻；加新配制的堿裂解液Ⅱ250μL混勻；加冰預(yù)冷的堿裂解液Ⅲ350μL混勻，冰浴3～5min；4℃，15000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清置另一離心管中；加等體積的酚?氯仿（1∶1），振蕩混合，室溫放置2min；4℃，15000r/min離心10min，棄上清，加70%乙醇1mL，反復(fù)混勻，4℃，15000r/min離心2min，室溫放置10～15min直至乙醇完全揮發(fā)；用去離子水重新溶解核酸，溫和振蕩數(shù)秒，-80℃保存。取部分再次用去離子水稀釋，測質(zhì)粒的吸光度值，直至稀釋到500ng/μL。

1.3 PreIQ及其突變體質(zhì)粒的DNA鑒定

1.3.1 質(zhì)粒DNA的酶切鑒定

該質(zhì)粒具有BamHⅠ和XhoⅠ兩個限制性酶切位點(diǎn)。質(zhì)粒DNA經(jīng)雙酶切后，瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定。

1.3.2 質(zhì)粒的DNA測序

將-80℃保存的1mL菌液送到公司進(jìn)行DNA測序。

1.4 融合蛋白的表達(dá)及純化

1.4.1 融合蛋白表達(dá)：取400μL菌種加入到裝有400mLLB培養(yǎng)液的錐形瓶中，37℃、100r/min振搖培養(yǎng)12～16h。當(dāng)A600在0.8左右時，加入IPTG至1mmol/L，37℃，120r/min振搖培養(yǎng)4h，誘導(dǎo)融合蛋白大量表達(dá)。

1.4.2 融合蛋白的純化：以下操作均在冰上進(jìn)行，離心均采用4℃離心機(jī)。菌液4000r/min離心8min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液（phosphate bufer，PBS）20mL重懸沉淀菌體，加入20mg/mL的LYS和1mol/L的DTT各100μL、15%的N?Lau 2mL，混勻冰上放置30min，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超3s停7s，4℃共5min。后加入30%TritonX?100666.67μL，冰上放置30min，14000r/min離心8min，棄沉淀。每10mL上清與250μLGS?4Bbeads 4℃結(jié)合過夜（beads用PBS洗3遍，600r/min，離心3min）。第2天用PBS溫柔清洗beads，每次5mL，600r/min離心3min洗3次，4℃保存。待測蛋白濃度。

1.5 純化后蛋白純度和濃度測定

1.5.1 PreIQ及其突變體的純度測定：15%SDS?PAGE電泳檢測純化的PreIQ及其突變體的相對分子量和純度。

1.5.2 PreIQ及其突變體的濃度測定：參照Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明測定PreIQ及其突變體的濃度。

1.6 PreIQ及其突變體的活性鑒定

用Pull?down的方法檢測純化后的PreIQ及其突變體的活性。具體方法為40μL的PreIQ及其突變體分別和30μL的CaM在300μL的Internal solution（aspartic acid 120mmol/L，KOH120mmol/L，KCl 24mmol/L，MgCl23.5mmol/L，HEPES10mmol/L，Na2ATP3mmol/L，EGTA1mmol/L，CaCl20.58mmol/L）中結(jié)合，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器4℃結(jié)合4h；用PBS溫柔清洗beads，每次600μL，600r/min離心3min洗2次；棄上清得beads；15%SDS?PAGE電泳檢測PreIQ及其突變體與CaM結(jié)合的情況，以了解純化后的蛋白是否具有生物活性。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

鑒定插入PreIQ或PreIQ突變體的pGEX?6p?1載體的質(zhì)粒。質(zhì)粒pGEX?6p?1經(jīng)BmaxHⅠ和XhoⅠ雙酶切插入PreIQ或PreIQ突變體。質(zhì)粒pGEX?6p?1約為4900bp，BmaxHⅠ和XhoⅠ之間的堿基全長為24bp，PreIQ或其突變體約為120bp，故PreIQ及其突變體的重組質(zhì)粒全長約為4900-24+120=4996bp。重組質(zhì)粒后經(jīng)BmaxHⅠ和XhoⅠ雙酶切應(yīng)該得到一個大分子量約為4876bp的DNA片段和一個小分子量約為120bp的DNA片段。瓊脂糖電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)不管是PeIQ還是其突變體的酶切圖譜上，在約4876bp和120bp處都有一明顯條帶（圖2），結(jié)果與預(yù)計(jì)相符，說明PreIQ及其突變體融合蛋白質(zhì)粒均構(gòu)建成功。

2.2 PreIQ及其突變體的DNA測序結(jié)果

圖2 PrelQ及其突變體質(zhì)粒的酶切鑒定瓊脂糖電泳圖Fig.2 Agarose electrodhoresis of PrelQand its mutnat plasmid digested by restriction endonucIease

DNA測序結(jié)果顯示PreIQ重組質(zhì)粒是含有120bp的DNA片段，基因同一性比較為100%，氨基酸同一性比較為100%，且插入方向正確，讀碼框架正確，無移碼突變，見圖3，進(jìn)一步證明本文構(gòu)建重組質(zhì)粒獲得成功。

圖3 PrelQ及其突變體重組質(zhì)粒的DNA測序結(jié)果Fig.3 The DNAsequence identification of GST?PreIQand its mutant

2.3 純化后蛋白的純度和濃度測定

GST蛋白的表觀分子質(zhì)量約為26kDa，PreIQ及其突變體的序列都含有40個氨基酸，表觀分子質(zhì)量約為4kDa。PreIQ及其突變體融合蛋白表觀分子質(zhì)量約為30kDa。結(jié)果顯示，在表觀分子質(zhì)量約30kDa處出現(xiàn)一條粗蛋白條帶，純度高，表達(dá)量大，此條帶即為PreIQ及其突變體的融合蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果一致；在表觀分子質(zhì)量約26kDa處出現(xiàn)一條細(xì)蛋白條帶，表達(dá)量小，此條帶認(rèn)為是GST蛋白條帶，見圖4。初步認(rèn)定提純獲得PreIQ及其突變體的GST融合蛋白。

圖4 純化后GST?PrelQ及其突變體蛋白SDS?PAGE圖Fig.4 SDS?PAGEof purification GST?PreIQand its mutant

采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒方法測定提純后的蛋白濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PreIQ重組蛋白和PreIQ突變體重組蛋白的濃度分別為2.24和2.05mg/mL。

2.4 PreIQ及其突變體融合蛋白的活性鑒定

應(yīng)用pull?down微量蛋白結(jié)合法，得到結(jié)果，見圖5，當(dāng)提純后的PreIQ與CaM結(jié)合時，在表觀分子量18kDa出現(xiàn)一條蛋白條帶，說明本實(shí)驗(yàn)提純后得到的PreIQ能與CaM結(jié)合，這一結(jié)果與某些國外的報道一致［4，5］；當(dāng)提純后的PreIQ突變體與CaM結(jié)合時，結(jié)合量很少，可以忽略不計(jì)，在表觀分子量18kDa處只出現(xiàn)一條很弱的條帶，說明本實(shí)驗(yàn)提純后的PreIQ突變體不能與CaM結(jié)合［2］。以上的結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)提純后得到的PreIQ及其突變體的GST融合蛋白都具有生物活性。

圖5 GST?PreIQ及其突變體與鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合的SDS?PAGE圖Fig.5 SDS?PAGEof CaMbinding with GST?PrelQand mutant GST?PrelQ

3 討論

近期研究發(fā)現(xiàn)鈣離子結(jié)合蛋白1（caldendrin，CaBP1）的一種突變體，能與PreIQ結(jié)合介導(dǎo)鈣離子的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，即鈣依賴性失活（Ca2+dependent in?activation，CDI）［6］。Ca2+/CaM有兩個臂（C?lobe和N?lobe），C?lobe也能與PreIQ結(jié)合［7］。與IQ基序相比，CaM與通道PreIQ的親和力較弱［2］。也有報道稱Cav1.2上EF和IQ基序間標(biāo)簽肽C、CB和PreIQ都能與CaM結(jié)合介導(dǎo)CDI。近年來人們在研究通道結(jié)合蛋白的作用機(jī)制中，經(jīng)常應(yīng)用到Cav1.2的PreIQ及其突變體的融合蛋白片段，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了PreIQ及其突變體的GST融合蛋白的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，誘導(dǎo)蛋白大量表達(dá)，為Cav1.2α1C亞單位上PreIQ及其突變體融合蛋白的純化提供方法。

原核表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展完善、流程簡單快速、成本低、產(chǎn)量高，尤其適宜于表達(dá)原核來源的以及不需要翻譯后修飾的真核蛋白。但在表達(dá)具體某種蛋白時，我們需要對表達(dá)條件進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化，以獲得高純度，高表達(dá)量的融合蛋白。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用雙酶切和DNA測序這兩種方法完成了PreIQ及其突變體融合蛋白質(zhì)粒的鑒定；并用SDS?PAGE電泳法確定純化后蛋白的純度，證明本方法獲得的蛋白純度高；使用Bradford法測定了純化后蛋白的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本方法提純后的蛋白濃度高，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行提供了可能性；應(yīng)用Pull?down法發(fā)現(xiàn)提純后的融合蛋白也具有生物活性。綜上所述，采用本方法可穩(wěn)定獲得高純度高濃度并具有生物活性的Pre?IQ及其突變體蛋白，為后續(xù)深入研究Cav1.2上Pre?IQ基序的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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（編輯 裘孝琦）

Vector Construction，Expression，Purificationand Identificationof PreI QandIts Mutant

SUNWei1，F(xiàn)ENGRui1，2，GUOFeng1，2，ZHAOJin?sheng1，2，ZHAOMei?mi1，2，GAOQing?hua1，2，WANGHong?mei1，MAONan1，HAOLi?ying1，2
（1.Department of Pharmaceutical Toxicology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Cardiovascular Institute of China Medical University，Shenyang110001，China）

ObjectiveTo develop prokaryotic expression vectors for PreIQand its mutant GSTfusion protein expressions，purification and activity identification.MethodscDNAs of PreIQand its mutant were cloned into pGEX?6p?1plasmid vector，and then transformed to theEscherichia coliBL21component cells.The transformed BL21cells were stimulated with IPTGfor the expression of GSTfusion proteins with PreIQand its mutant.The fusion proteins were purified with Glutathione?Sepharose 4Bbeads.SDS?PAGEwas used to detect the purity and relative molecular weight.Bradford method was used to determine the concentration of purified PreIQand its mutant.The protein activity was examined by pull?down method.ResultsSDS?PAGEshowedhighpurityofPreIQanditsmutantwiththeconcentrationaround2mg/mL，whichwasenoughformolecularbiological and electrophysiological studies.The purified PreIQand its mutant in this study successfully bind to CaM.ConclusionProkaryotic expression vec?tors of PreIQand its mutant fusion proteins were successfully constructed，and bioactive fusion proteins were obtained.These results provided a basis forfurtherbiologicalfunctionstudiesofPreIQ.

fusion protein；PreIQ；mutant；pull?down

R966

A

0258-4646（2014）03-0293-04

http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20140429.1439.004.html

國家自然科學(xué)基金（31071004；81001429；81100108）

孫威（1985-），女，博士研究生.

郝麗英，E-mail：lyhao@mail.cmu.edu.cn

2013-12-03

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-04-2914:39

·論著·