李本祥，董新榮，羅 景

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，湖南 長沙 410128）

隨著能源問題的日益突出，人們對可再生能源越來越重視，加強(qiáng)對木質(zhì)纖維素類可再生資源高值利用研究對解決能源危機(jī)具有重要的戰(zhàn)略意義[1-3]。芒屬植物以C4循環(huán)方式進(jìn)行光合作用，生長迅速，生活周期短，抗逆性強(qiáng)，產(chǎn)量高且纖維素和半纖維素占總量的80%以上，是一種理想制備燃料乙醇的木質(zhì)纖維素原料[4]。但木質(zhì)纖維素由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，纖維素、半纖維素不但被木質(zhì)素包裹，而且半纖維素部分共價(jià)和木質(zhì)素結(jié)合，纖維素具有高度有序晶體結(jié)構(gòu)，使其纖維素酶解嚴(yán)重受限，因此必須對其進(jìn)行預(yù)處理以去除部分或全部木質(zhì)素，或在一定程度上改變原料物理化學(xué)結(jié)構(gòu)，如降低結(jié)晶度，減小聚合度，增加孔隙度和表面積等，以促進(jìn)酶與底物相互接觸并反應(yīng)，提高酶解速率和總糖得率[5-7]。目前已知預(yù)處理方法有物理法、化學(xué)法和生物法等，但每種方法單獨(dú)使用其預(yù)處理效果和成本都有待改進(jìn)[8]。三氟乙酸能夠破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)[9]，超聲具有波長較短、能量集中的特點(diǎn)，在各行業(yè)有廣泛的用途，但利用超聲波破壞纖維素晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道較少[10]。本研究以三氟乙酸/超聲波聯(lián)合預(yù)處理方式處理芒草，考察不同的預(yù)處理?xiàng)l件對纖維素晶體結(jié)構(gòu)及酶解效果的影響，為進(jìn)一步開發(fā)以芒草為原料生產(chǎn)生物乙醇技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

芒草秸稈取自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，洗凈自然風(fēng)干后切成1～2cm 的小段，在60℃下干燥36h ,然后用植物粉碎機(jī)粉碎，過0.84mm篩, 室溫貯存干燥器中備用。

1.2 芒草秸稈的預(yù)處理

取粉碎后的芒草秸桿5g置于250mL具塞磨口瓶中，加入三氟乙酸溶液，置于超聲波發(fā)生器中對試樣進(jìn)行預(yù)處理，考察不同的條件對預(yù)處理糖化率和芒草酶解糖化率的影響。

1.3 預(yù)處理樣品的酶解

試樣的酶解采用文獻(xiàn)[11]方法。取2g纖維素酶(酶活力15000 U·g-1)溶于1000mL的pH為4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中。稱取預(yù)處理后的芒草樣品3g置于100 mL碘量瓶中，加入33mL纖維素酶溶液（相當(dāng)于22mg·g-1），搖勻，置于恒溫水浴振蕩器中，45℃、165r·min-1酶水解 72h，過濾，測濾液中的還原糖，其含量采用DNS 法測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)處理對芒草秸桿組成和結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 XRD分析

XRD曲線可以很好地描述纖維素結(jié)晶的狀況。圖1為預(yù)處理前后芒草中纖維素的X衍射圖。由圖1可以看出，預(yù)處理前芒草中纖維素在2θ為22.3°和16.1°各有一個(gè)主要峰和次要峰。主要峰代表的是002面峰的強(qiáng)度，即結(jié)晶區(qū)的衍射強(qiáng)度，次要峰代表的是無定形區(qū)的強(qiáng)度。樣品經(jīng)過三氟乙酸溶液處理之后，次要峰變成一組強(qiáng)度很低分布很寬的衍射峰，峰形不再尖銳明顯，主要峰強(qiáng)度也明顯降低。說明纖維素經(jīng)過三氟乙酸溶液處理之后，原有晶形受到破壞，結(jié)晶度大大降低，這樣可為纖維素酶解組分中剪切作用最快、效果最好的內(nèi)切酶提供更多更好的作用位點(diǎn)，可加快酶解速率，提高還原糖的轉(zhuǎn)化率，這在后面酶解實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。同時(shí)從圖1（A線）中可以看出，纖維素經(jīng)過三氟乙酸/超聲波聯(lián)合預(yù)處理后，次要峰已經(jīng)完全消失，主要峰的強(qiáng)度進(jìn)一步降低，說明超聲波能夠加速纖維素晶形破壞程度，使芒草中纖維素結(jié)晶度下降更為明顯，經(jīng)三氟乙酸/超聲波聯(lián)合預(yù)處理的底物有更好的酶解效果。

圖1 不同預(yù)處理方式的纖維素的XRD圖Figur e 1 XRD pat ter ns of cel l ul ose sampl es

2.1.2 FTIR分析

由于芒草中纖維素的官能團(tuán)和化學(xué)鍵在紅外光譜中的特定頻率都已經(jīng)知道，因此通過紅外光譜可以定性和定量分析纖維素中存在的官能團(tuán)以及它們在預(yù)處理前后的變化[12]。預(yù)處理前后芒草中纖維素的紅外光譜圖見圖2。從圖2中可以看出，預(yù)處理前后纖維素的紅外吸收峰形狀基本相同，但是吸收強(qiáng)度有所不同，表明預(yù)處理使纖維素的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。經(jīng)過酸處理后，表征纖維素中-CH，-CH2伸縮振動的波數(shù)為2900cm-1，吸收峰強(qiáng)度降低，表明纖維素大分子中甲基、亞甲基發(fā)生了部分?jǐn)嗔?，采用三氟乙?超聲波聯(lián)合預(yù)處理時(shí)，波數(shù)為2900cm-1的吸收峰強(qiáng)度降低得更明顯，說明對纖維素結(jié)構(gòu)破環(huán)得更為嚴(yán)重。波數(shù)1635 cm-1處的吸收峰是表征吸附水的伸展振動，經(jīng)預(yù)處理后的纖維素中1635 cm-1處吸收峰強(qiáng)度都要明顯高于未處理的纖維素中此處吸收峰，說明經(jīng)過三氟乙酸溶液特別是在超聲波的輔助作用下預(yù)處理后的物料中纖維素都明顯得到潤脹，對水的可及度增加。纖維素的潤脹對提高芒草的酶解效率起著重要的作用。

圖2 不同預(yù)處理方式的纖維素的紅外光譜圖Figure 2 FTIR spect ra of as-r eceived untr eated sampl e

2.1.3 SEM分析

進(jìn)一步利用SEM技術(shù)從宏觀角度對預(yù)處理前后的芒草纖維素的形貌進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。未處理的芒草表面結(jié)構(gòu)比較緊密、有序，質(zhì)地也比較堅(jiān)硬（圖3A），纖維素分子表面十分平滑，結(jié)構(gòu)相當(dāng)規(guī)整，可見分子的平行排布形式（圖3a）；經(jīng)三氟乙酸溶液預(yù)處理后纖維素結(jié)構(gòu)變得蓬松、柔軟，且具有部分微孔（圖3B），纖維素分子表面凹凸不平，有點(diǎn)狀突起并夾雜有小孔洞，纖維素表面蠟質(zhì)及硅晶體受到破壞（圖3b）；在超聲波輔助作用下纖維素顆粒變得細(xì)?。▓D3C），芒草纖維束發(fā)生斷裂，纖維素晶體受到破損（圖3c）。因此纖維素經(jīng)過預(yù)處理后，特別是經(jīng)過聯(lián)合預(yù)處理之后，纖維素晶體結(jié)構(gòu)破損，纖維素表面積增加，提高了芒草纖維素與纖維素酶的可及度，從而提高纖維素的酶解效率。

圖3 不同預(yù)處理方式的纖維素的SEM圖Figur e3 Scanning el ect r on micr ogr aphs of sampl e

2.2 預(yù)處理方式的選擇

圖4 為采用不同預(yù)處理方式處理2h后在1.3的酶解條件下（下同）對試樣進(jìn)行酶解后的效果。從A和B及C和D比較可以看出，在超聲波的輔助作用下預(yù)處理試樣的酶解效果明顯好于未使用的，說明超聲波預(yù)處理有利于加快芒草的酶水解，主要原因是超聲波具有空化作用，能夠破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，增加試樣的酶解可及率，提高其酶解糖化率。

經(jīng)過以上分析，超聲波能提高纖維素酸處理效果，后面的研究擬在采用超聲波的輔助作用下，用三氟乙酸預(yù)處理芒草，考察不同的預(yù)處理?xiàng)l件對纖維素酶水解效果的影響。

圖4 不同預(yù)處理方式的酶解效果Fig4 Enzymatic hydrolysis efficiency of different pretreated silvergrass

2.3 三氟乙酸濃度對預(yù)處理效果的影響

在預(yù)處理溫度為30℃，時(shí)間為4h，固液比為1∶30情況下，以不同的三氟乙酸濃度處理芒草樣品，然后進(jìn)行酶解,其結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，在酸處理后濾液中，糖含量隨著酸濃度的提高而升高，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[13]。但對酸處理試樣進(jìn)行酶解時(shí)，其酶解糖化率隨著酸濃度升高而升高，當(dāng)酸濃度進(jìn)一步升高時(shí)，其酶解糖化率明顯降低。這是因?yàn)樗釢舛仍礁撸A(yù)處理濾液中糖含量升高，消耗纖維素和半纖維素的量增大，預(yù)處理后試樣中可供酶解的纖維素和半纖維素的含量相對降低，其酶解得率相應(yīng)也會降低。同時(shí)，隨著酸濃度的升高，生成酶解抑制物如糠醛的含量也會升高，不利于后續(xù)酶解的反應(yīng)[13-14]。因此，在預(yù)處理過程中，以40%的酸濃度比較合適，其處理后試樣酶解糖化率達(dá)到64.6%以上。

圖5 三氟乙酸濃度對預(yù)處理效果的影響Fig5 Effect of trifluoroacetic acid concentration on the pretreatment ef f ect iveness

2.4 固液比對預(yù)處理效果的影響

在預(yù)處理酸濃度為40%，溫度為30℃，時(shí)間為4h情況下，以不同的固液比處理芒草然后對其進(jìn)行酶解,其結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，隨著固液比增加，其預(yù)處理糖化率和酶解糖化率隨著固液比的升高而升高，預(yù)處理糖化率隨固液比提高而增加不明顯，而酶解糖化率隨著固液比的升高而提高，當(dāng)固液比達(dá)到1∶30時(shí)，其增加不明顯，故預(yù)處理時(shí)選擇固液比為1∶30。

圖6 固液比對預(yù)處理效果的影響Fig6 Effect of ratio of solid-liquid on the pretreatment effectiveness

2.5 預(yù)處理時(shí)間對預(yù)處理效果的影響

在預(yù)處理酸濃度為40%，固液比為1∶30，溫度為30℃的情況下，采用不同的處理時(shí)間處理芒草樣品，酶解，其結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，隨著預(yù)處理時(shí)間的增加，預(yù)處理糖化率變化不明顯，而預(yù)處理試樣酶解糖化率在預(yù)處理時(shí)間達(dá)到3h以上時(shí)，變化不明顯，故選擇預(yù)處理時(shí)間為3h。

圖7 預(yù)處理時(shí)間對預(yù)處理效果的影響Fig7 Ef f ect of time on t he pr et r eat ment ef f ect iveness

2.6 預(yù)處理溫度對預(yù)處理效果的影響

在預(yù)處理酸濃度為40%，固液比為1∶30，時(shí)間為3h，以不同的溫度處理芒草樣品，酶解，其結(jié)果如圖8所示。從圖8中可以看出，隨著預(yù)處理溫度的升高，預(yù)處理糖化率有所增加，但變化不明顯，而試樣酶解糖化率則明顯降低。當(dāng)預(yù)處理溫度升高時(shí)，半纖維素水解所產(chǎn)生的木糖在高溫下會進(jìn)一步降解為糠醛，糠醛對酶解具有明顯的抑制作用[15]；同時(shí)，在高溫下三氟乙酸與葡萄糖發(fā)生酯化反應(yīng)，所產(chǎn)生的副產(chǎn)物也會對酶解產(chǎn)生一定的抑制作用。根據(jù)紅外譜圖和預(yù)處理試樣酶解效果分析，在低溫下進(jìn)行預(yù)處理對試樣酶解效果有利，由于超聲波在空化過程中具有加熱作用，很難維持低溫，故選擇預(yù)處理溫度為30℃。

圖8 溫度對預(yù)處理效果的影響Fig8 Effect of temperature on the pretreatment effectiveness

3 結(jié)論

三氟乙酸/超聲波預(yù)處理芒草能夠有效破壞纖維素的晶形結(jié)構(gòu)，增加纖維素酶與底物的酶解可及度，促進(jìn)了芒草秸桿的酶解糖化率。在40%三氟乙酸溶液、30℃、固液比為1∶30及超聲波的輔助作用下預(yù)處理4h的芒草秸桿，在pH為4.6、加酶量22mg·g-1、45℃下酶解72h，其酶解糖化率可達(dá)64.6%。

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