張曉燕 周 斌

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。2011年美國《Chemical Abstracts》雜志公布的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，僅2011年美國就將有20萬以上的女性罹患乳腺癌，其發(fā)生率已占據(jù)婦科腫瘤的31%［1］。近年來主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類相關(guān)基因A(MICA)越來越吸引研究者興趣。腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)NK細(xì)胞的活化型受體(NKG2D)的配體MICA蛋白，激活NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，殺滅腫瘤細(xì)胞。隨著腫瘤進(jìn)展，組織細(xì)胞的MICA從腫瘤細(xì)胞表面脫落到癌細(xì)胞周圍的間質(zhì)組織及血液中，成為可溶性MICA，下調(diào)NK細(xì)胞對抗腫瘤細(xì)胞的作用，可能是腫瘤免疫逃逸的機(jī)制［2，3］。本研究通過檢測乳腺癌組織及血清中MICA表達(dá)水平，探討其與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)臨床參數(shù)的相關(guān)性，為臨床診斷提供新的參考，為進(jìn)一步以MICA為靶點(diǎn)進(jìn)行乳腺癌免疫治療提供基礎(chǔ)。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)對象:收集具有明確病理和影像學(xué)診斷的乳腺癌患者組織32例，按照1972年國際抗癌協(xié)會(huì)修訂的乳腺癌臨床分期法分期，其中Ⅰ期+Ⅱ期15例，Ⅲ期+Ⅳ期18例;同時(shí)收集血清56例，患者年齡25～69歲，平均年齡43．5歲;乳腺良性疾病組69例，包括乳腺纖維瘤，乳腺小葉增生等其他乳腺疾病患者，年齡23～67歲，平均年齡45．2歲;筆者醫(yī)院女性健康體檢者75例為正常對照組，年齡21～65歲，平均年齡 41．6 歲。

2．RT-PCR檢測:MICA液氮研磨約1g組織標(biāo)本，Trizol試劑提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行MICA的PCR反應(yīng)，引物序列為上游:5'-CTGTGCCATACCAGTTAA-3'，下 游:5'-ATCAAGGACCAGAAAGAAGG-3'，產(chǎn)物片段長439bp;PCR反應(yīng)條件:94℃ 2min，94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 45s，循環(huán) 35 次，72℃ 延伸5min，4℃保存;PCR產(chǎn)物上樣于1．5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)分析，以MICA和β-actin電泳帶的熒光強(qiáng)度灰度值的比值表示其mRNA的相對表達(dá)量。

3．血清MICA檢測:收集各組患者及健康體檢者血清標(biāo)本，儲(chǔ)藏于-70℃冰箱備用。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測各標(biāo)本中MICA濃度。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:運(yùn)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)來描述，陽性率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．乳腺癌組織MICA PCR結(jié)果分析:乳腺癌及癌旁組織MICA PCR電泳結(jié)果如圖1所示，乳腺癌病灶組織和相應(yīng)的癌旁組織陽性表達(dá)率分別為81．25%(26/32)和9．38%(3/32)。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖

2．乳腺癌組織MICA mRNA表達(dá)水平與臨床病理特征相關(guān)性分析:以MICA和β-actin電泳帶的熒光強(qiáng)度灰度值的比值表示其 mRNA的相對表達(dá)量，乳腺癌組MICA mRNA相對表達(dá)量為1．36±0．18，顯著高于乳腺癌旁組織0．76±0．09;15例Ⅰ期+Ⅱ期乳腺癌組織MICA mRNA相對表達(dá)量表示成1．75±0．39，顯著高于Ⅲ期 + Ⅳ期 0．96 ±0．13(P ＜0．01);其表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯的相關(guān)性。

3．血清中MICA的ELISA結(jié)果:與56例乳腺癌患者M(jìn)ICA水平相比，乳腺良性病組和健康體檢者其濃度明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。乳腺良性病患者血清MICA較健康體檢者高，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

表1 各組血清MICA ELISA檢測結(jié)果

4．MICA濃度與乳腺癌臨床病理特征相關(guān)性:33例Ⅲ期+Ⅳ期乳腺癌患者血清中含量明顯高于Ⅰ期+Ⅱ期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者M(jìn)ICA濃度明顯高于未轉(zhuǎn)移者，MICA濃度與患者年齡和分化程度無明顯相關(guān)性，具體情況見表2。

表2 MICA濃度與乳腺癌臨床病理特征相關(guān)性

討 論

近年來乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅健康，對乳腺癌的早期診斷是提高生存率和生活質(zhì)量的關(guān)鍵。NK細(xì)胞在控制腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，通過識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面活化和抑制性分子標(biāo)志，從而控制對腫瘤細(xì)胞殺傷作用。NKG2D是NK細(xì)胞表面一個(gè)重要的激活性受體，能識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類相關(guān)基因A(MICA)，從而激活NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，殺滅腫瘤細(xì)胞［4］。研究表明早期分化程度較高的腫瘤組織細(xì)胞MICA表達(dá)量較高，迅速誘導(dǎo)NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞發(fā)揮免疫監(jiān)視作用。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織MICA mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，說明MICA來源于腫瘤組織，可能作為乳腺癌診斷新的潛在標(biāo)志物。晚期腫瘤細(xì)胞表面MICA蛋白脫落釋放到間質(zhì)及血清中形成可溶性MICA進(jìn)而引起腫瘤免疫逃逸［5，6］。血清中可溶性MICA可通過ELISA法進(jìn)行檢測，本實(shí)驗(yàn)中筆者檢測出乳腺癌血清中其水平明顯高于良性疾病和健康體檢者，說明其來自腫瘤組織。隨著腫瘤進(jìn)一步進(jìn)展，血清中濃度明顯升高，腫瘤細(xì)胞表面的MICA脫落到血清中變成的可溶性sMICA進(jìn)一步加劇，從而導(dǎo)致其失去介導(dǎo)NKG2D殺滅腫瘤細(xì)胞的作用，故可能作為腫瘤逃逸指標(biāo)［7］。

本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期+Ⅱ期乳腺癌組織MICA mRNA表達(dá)顯著高于Ⅲ期+Ⅳ期，而Ⅲ期+Ⅳ期乳腺癌患者血清中MICA蛋白表達(dá)量顯著高于Ⅰ期+Ⅱ期。乳腺癌患者初期腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)MICA，組織中表達(dá)水平增高，隨著腫瘤進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞表面MICA蛋白脫落釋放到間質(zhì)及血清中形成可溶性MICA進(jìn)而引起腫瘤免疫逃逸，此時(shí)組織中MICA檢測量降低，而血清中可溶性MICA量升高，血清可溶性MICA隨著分期逐漸升高，削弱了NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞免疫抑制作用，可以此為腫瘤免疫治療研究靶點(diǎn)。同時(shí)血清中可溶性MICA還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能作為乳腺癌轉(zhuǎn)移與否的輔助判斷指標(biāo)。

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