李韻秋 匡志鵬 吳繼寧 孔 娜 楊 帆
原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(primary human hepatocellular,HCC)是現(xiàn)今常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)生率在我國有明顯增加趨勢,比歐美國家高5~10倍,是全球發(fā)生率最高的國家[1,2]。有研究顯示,肝癌的發(fā)生、發(fā)展是肝癌細(xì)胞無限增殖與凋亡減少的結(jié)果,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中扮演著重要角色,隨著對肝癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞內(nèi)部的某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活或抑制與肝癌的發(fā)生、發(fā)展等有著緊密的聯(lián)系。近幾年來,Hedgehog信號通路在肝癌發(fā)生、發(fā)展變化中的作用進(jìn)行了初步的探索,大多數(shù)報道結(jié)果為肝癌發(fā)生與Hedgehog信號通路關(guān)系密切,并且是最近探討肝癌機制研究的熱點,但是具體作用尚不清楚[3]。本研究通過觀察HH信號通路成員Shh、Ptch和Smo在化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌模型中的動態(tài)表達(dá)情況,探討Hedgehog信號通路與肝癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。
1.主要試劑與藥品:免疫組織化學(xué)用Shh、Ptch和Smo兔抗鼠多克隆抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司)。SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)??俁NA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司)。M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大MBI Fermentas公司)。引物由上海生工生物有限公司合成。Real-Master Mix(SYBR Green)(Takara公司)。定量PCR儀為美國MJR公司產(chǎn)品。組織蛋白裂解液及發(fā)光底物試劑盒(上海碧云天Beyotime公司),蛋白質(zhì)印跡檢測用Shh和Ptch兔抗鼠多克隆抗體(美國Millipore公司),Smo兔抗鼠多克隆抗體(美國Abcam公司),GAPDH單克隆抗體和羊抗兔二抗(美國CST公司)。
2.C57BL/6J小鼠肝癌模型制備:小鼠造模階段已在前期實驗中獲得成功,簡要過程如下:選取符合標(biāo)準(zhǔn)的95只正常C57BL/6J雄性小鼠,隨機分為對照組45只及誘癌組50只,對照組僅喂以小鼠顆粒飼料及滅菌普通水,誘癌組采用化學(xué)法[二乙基亞硝胺(DEN)/四氯化碳(CCl4)/乙醇]誘發(fā)小鼠肝癌,于誘癌開始后第4周隨機處死誘癌組及對照組小鼠各5只,此后以相同方法處理第6、8、10、12、14、16、18 和 20 周的兩組小鼠,獲取各周期誘癌組和對照組肝組織標(biāo)本,蘇木精-伊紅(HE)染色鏡檢提示成功誘發(fā)小鼠肝癌,具體步驟參見文獻(xiàn)[4]。
3.免疫組織化學(xué)檢測Shh、Ptch和Smo的表達(dá):SP法簡略步驟:組織標(biāo)本石蠟包埋-切片-脫蠟-抗原修復(fù)-滴加一抗4℃過夜-按照試劑說明書二抗孵育-DAB顯色-蘇木素復(fù)染-脫水封片。每例切片隨機選取10個高倍視野,根據(jù)陽性細(xì)胞百分率及顯色深淺采用半定量積分法分級[5],評分標(biāo)準(zhǔn)為:(1)陽性細(xì)胞百分率:未見陽性細(xì)胞者為0分,<25%為1分,25% ~75%為2分,>75%為3分。(2)顯色深淺:不顯色或顯色不清為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分,將以上2項相加最終評定結(jié)果,0~1分為陰性(-),2~3分為弱陽性(+),4~5分為中度陽性(++),>5分為強陽性(+++),且陽性結(jié)果定義為細(xì)胞質(zhì)伴或不伴有細(xì)胞膜上呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色Shh、Ptch蛋白顆粒,細(xì)胞核伴或不伴有細(xì)胞膜上呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色Smo蛋白顆粒。
4.RT-PCR法檢測Shh、Ptch和Smo mRNA的表達(dá):按照試劑盒對組織標(biāo)本進(jìn)行總RNA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄。Shh基因上游引物:5'-AAAGCTGACCCCTTTAGCCTA-3';下游引物:5'-TTCGCAGTTTCTTGTGATCTTCC-3'。Ptch基因上游引物:5'-AAAGAACTGCGGCAAGTTTTTG-3';下游引物:5'-CTTCTCCTATCTGACGGGT-3'。Smo基因上游引物:5'-ATGATGGACCTGTTGCG-3';下游引物:5'-GTTGGCTTGTTCTTCTGG-3'。β-actin基因上游引物:5'-GTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3';下游引物:5'-GCTGCCTCAACACCTCAACCC-3'。按25μl反應(yīng)體系進(jìn)行。反應(yīng)條件為:95℃30s,95℃ 5s,62.2℃ 30s,共 40 個循環(huán)。得到目的基因及相應(yīng)內(nèi)參的CT值。
5.Western blot法檢測 Shh、Ptch和 Smo蛋白的表達(dá):內(nèi)參選用GAPDH,實驗簡要步驟:提取組織總蛋白測定其濃度-電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-滴加一抗4℃培育過夜-加入羊抗兔IgG-HRP二抗-洗膜,然后按化學(xué)發(fā)光法試劑盒的說明書進(jìn)行發(fā)光、壓片。
6.統(tǒng)計學(xué)方法:統(tǒng)計學(xué)分析軟件SPSS 16.0。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,均數(shù)間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
1.免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果:對照組小鼠肝組織中未檢測到Shh、Ptch和Smo蛋白的表達(dá)(圖1A、圖2A和圖3A)。在誘癌組中,3種蛋白在小鼠肝癌組織中的表達(dá)結(jié)果為第6周時檢測Shh蛋白的表達(dá)為弱陽性(圖1B),第16周時出現(xiàn)中度陽性(圖1C),到第20周時Shh蛋白在小鼠肝癌組織中的表達(dá)為強陽性(圖1D)。誘癌組小鼠肝癌組織中Ptch蛋白在第8周時的表達(dá)結(jié)果為弱陽性(圖2B),第16周時在小鼠肝癌組織中的表達(dá)結(jié)果為中度陽性(圖2C),到第20周時表達(dá)結(jié)果為強陽性(圖2D)。且小鼠肝癌組織中Smo蛋白分別在第10周、第16周和第20周時出現(xiàn)弱陽性、中度陽性和強陽性表達(dá)(圖3B~D)。
圖1 免疫組織化學(xué)法檢測Shh在化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌組織中表達(dá)情況(×400)
2.實時熒光定量PCR檢測結(jié)果:通過已知相對定量方法分析數(shù)據(jù):①改變的倍數(shù)(fold change)=2-ΔΔCT;②ΔΔCT=(CT 靶基因 -CT 內(nèi)參)誘癌組-(CT靶基因-CT內(nèi)參)實驗組。如表1所示,誘癌組小鼠肝組織和其對應(yīng)的正常對照組小鼠肝組織的表達(dá)顯示:誘癌組與對照組兩者的小鼠肝組織中Shh mRNA和Ptch mRNA的表達(dá)在第4周時差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。從第6周開始(包括第6周),誘癌組中Shh mRNA和Ptch mRNA的表達(dá)均明顯高于對照組中的表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.001)。而Smo誘癌組與Smo對照組兩者的小鼠肝組織中Smo mRNA的表達(dá)在第4周和第6周時差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。從第8周開始(包括第8周),Smo誘癌組中Smo mRNA的表達(dá)才明顯高于Smo對照組中的表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P <0.001)。
圖2 免疫組織化學(xué)法檢測Ptch在化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌組織中表達(dá)情況(×400)
圖3 免疫組織化學(xué)法檢測Smo在化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌組織中表達(dá)情況(×400)
表1 不同誘癌周期小鼠肝組織中Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA分別在其誘癌組的表達(dá)與其相對應(yīng)對照組的表達(dá)比較(2-ΔΔCT)
同一對照組中各周期之間的表達(dá)顯示:對照組中小鼠肝組織中的Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA 的表達(dá)在第4、6、8、10、12、14、16、18、20 周變化均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而同一誘癌組中后一周期與前一周期之間的表達(dá)顯示:Shh誘癌組中,9個階段中,后一周期Shh mRNA的表達(dá)水平均顯著高于前一周期的表達(dá)水平,表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P <0.001)。Ptch誘癌組中,Ptch mRNA 在第 6周的表達(dá)與第4周的表達(dá)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),第8周時的Ptch mRNA表達(dá)明顯高于第6周(P<0.05),第10周時的表達(dá)同樣明顯高于第8周(P<0.05),第12周的表達(dá)與第10周的表達(dá)差異卻無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此后,后一周期Ptch mRNA的表達(dá)水平均顯著高于前一周期的表達(dá)水平,表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05,P <0.001)。Smo誘癌組中,Smo mRNA在第6周的表達(dá)與在第4周的表達(dá)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),第8周時的Smo mRNA表達(dá)與第6周時的表達(dá)、第10周時與第8周時的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),到第12周時,Smo mRNA的表達(dá)與第10周時比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。此后,第14周表達(dá)明顯高于第12周(P<0.05),第16周明顯高于第14周(P<0.05),第 18周明顯高于第 16周(P<0.05),第20周時達(dá)最高,與第18周時比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
從整個誘癌過程可以看出,隨著小鼠誘癌周期的增長,誘癌組的3種mRNA的表達(dá)量分別均呈逐步上升趨勢,至第20周時3組誘癌組中三者表達(dá)水平均達(dá)到各自的最高值,分別是Shh mRNA為15.986±1.784,Ptch mRNA 為 11.272 ± 0.295,Smo mRNA為10.185 ±0.716。
4.蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果:如圖4所示。以誘癌組中GAPDH(37kDa)(圖4中D1)的表達(dá)條帶為準(zhǔn),設(shè)定為強表達(dá)。3種蛋白在誘癌組小鼠肝癌組織中的表達(dá)結(jié)果為誘癌組第4周時,未檢測出Shh蛋白的表達(dá),第6周開始出現(xiàn)Shh蛋白的表達(dá),此時表達(dá)較弱,從第8周至第20周表達(dá)增強,第16周、第18周和第20周時表達(dá)的條帶均有增寬(圖4中A1,Shh 45kDa)。誘癌組中Ptch蛋白在第4周和第6周均未檢測出,到第8周時出現(xiàn)較弱的表達(dá),第10周到第14周表達(dá)量有所增加,至第16~20周時出現(xiàn)強表達(dá)(圖4中B1,Ptch 160kDa)。而誘癌組Smo蛋白到第10周時方檢測出蛋白的表達(dá),隨著誘癌時間的遞增,Smo蛋白的表達(dá)量逐漸增多,第20周表達(dá)最顯著,條帶明顯增寬(圖4中C1,Smo 86kDa)。以對照組中GAPDH(37kDa)(圖4中D2)的表達(dá)條帶為準(zhǔn),設(shè)定為強表達(dá)。對照組小鼠肝組織中未檢測到Shh、Ptch和Smo蛋白的表達(dá)(圖4中A2、B2、C2)。
圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測Shh、Ptch和Smo蛋白在誘癌組及對照組小鼠肝癌組織中的表達(dá)情況
Hedgehog(HH)信號通路是一條高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在胚胎的發(fā)育成熟、器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持、組織損傷后的修復(fù)和再生、某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤的分化與浸潤中起重要作用,是維持腫瘤干細(xì)胞的重要信號通路[6]。最近越來越多的研究顯示,當(dāng)該通路被異常激活時能導(dǎo)致多種腫瘤形成,如基底細(xì)胞癌、胃癌和胰腺癌等[7~9]。HH信號通路的失調(diào)同樣也參與肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展,從肝臟的胚胎發(fā)生上來看,肝臟來源于前腸末端的肝憩室,HH信號通路在胚胎肝細(xì)胞增殖和分化調(diào)控中起重要作用,但是隨著肝臟的逐漸形成,HH信號通路相關(guān)蛋白也逐漸消失,在正常成人肝臟中,Hedgehog信號通路處于靜止?fàn)顟B(tài),不表達(dá)或很少表達(dá)。但不少研究者發(fā)現(xiàn),該通路成分在肝癌中出現(xiàn)了異常高表達(dá),在肝癌組織中可見Hedgehog信號通路的異常激活[10]。其中,Shh配體,跨膜蛋白受體Ptch和Smo是Hedgehog信號通路的核心成員。研究表明,Shh基因是編碼一系列分泌蛋白的基因家族,它編碼一系列分泌型信號蛋白,1980年首先在果蠅基因分析中被發(fā)現(xiàn),其編碼的Shh蛋白是整條信號通路的啟動因子,是Hedgehog信號通路的重要組成部分[11]。Smo基因為原癌基因,編碼的Smo蛋白屬于G蛋白偶聯(lián)受體,有7個跨膜區(qū),在HH信號通路中發(fā)揮著橋梁作用。有研究認(rèn)為Ptch可能發(fā)揮抑癌作用,是一個抑癌基因,能特異性抑制Smo的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,避免HH信號通路過度活化引發(fā)腫瘤。在沒有Shh配體信號刺激下,Ptch與Smo結(jié)合,抑制Smo的活性,該信號通路處于失活狀態(tài)。過多的Shh蛋白表達(dá)使Shh蛋白與Ptch蛋白結(jié)合,解除了Ptch蛋白對Smo的抑制,Smo被激活,繼而激活轉(zhuǎn)錄因子Gli,進(jìn)而啟動下游基因的表達(dá),從而調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展。
本研究通過建立C57BL/6J小鼠原發(fā)性肝癌動物模型,并采用免疫組織化學(xué)法、實時熒光定量PCR技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法檢測Shh、Ptch和Smo三者的基因及蛋白在該模型中的定性和定量表達(dá)情況,更好地了解Hedgehog信號通路在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中可能的機制。結(jié)果顯示,免疫組織化學(xué)法、實時熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法在對照組全程均未檢測到Shh、Ptch和Smo的顯著性變化,主要原因是正常肝細(xì)胞中三者僅出現(xiàn)微量變化,實驗方法的敏感度使檢測受到限制。誘癌組前期Shh、Ptch和Smo三者的變化也均不明顯:免疫組織化學(xué)法顯示,誘癌組Shh、Ptch和Smo蛋白分別在第6周、第8周和第10周才出現(xiàn)弱陽性。實時熒光定量PCR法檢測結(jié)果顯示,與正常對照組比較,誘癌組小鼠肝組織中Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA的表達(dá)分別至第6周、第6周和第8周開始,才明顯高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05,P <0.001)。
蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示,誘癌組Shh、Ptch和Smo蛋白分別從第6周、第8周和第10周起出現(xiàn)弱表達(dá)。這說明在誘癌前期小鼠肝組織僅為炎癥反應(yīng)性病變,三者的表達(dá)有所上升,但是上升的幅度并不大,由于免疫組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果為定性分析,未能表述出蛋白在量上的變化趨勢,因此表達(dá)差異并未檢測出。只有實時熒光定量檢測敏感度高,得到Shh、Ptch和Smo在此期間的變化差異。從第10周開始至第14周,各誘癌組與同一組別同一周期對照組的Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA的表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.001)。且三者的表達(dá)量在此過程中是逐漸增加的趨勢,Shh誘癌組中,后一周期Shh mRNA的表達(dá)水平均顯著高于前一周期的表達(dá)水平(P<0.05),Ptch mRNA和Smo mRNA兩者在第14周期的表達(dá)也明顯高于在第12周期的表達(dá)(P<0.05)。在第16周時,小鼠肝組織重度非典型增生。同時免疫組織化學(xué)法檢測Shh、Ptch和Smo蛋白表達(dá)均呈中度陽性;實時熒光定量PCR檢測Shh mRNA、Ptch mRNA和Smo mRNA的表達(dá)大幅度上升。蛋白質(zhì)印跡法顯示三者的目的條帶較前均有所增寬。此后隨著誘癌周期的遞增,Shh、Ptch和Smo的表達(dá)在定量和定性方法檢測中均呈上升趨勢,到20時達(dá)最盛。此時免疫組織化學(xué)法檢測Shh、Ptch和Smo表達(dá)均呈強陽性;實時熒光定量PCR 法(計算結(jié)果 Shh mRNA 為15.986±1.784,Ptch mRNA 為 11.272 ± 0.295,Smo mRNA 為 10.185 ±0.716)和蛋白質(zhì)印跡法檢測三者表達(dá)均達(dá)最大化,此時癌組織已經(jīng)形成。
實驗結(jié)果提示,化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌模型建立的過程是一個由量變轉(zhuǎn)化到質(zhì)變的動態(tài)變化過程,簡陋的解釋了Hedgehog信號通路中Shh、Smo和Ptch在分子水平的變化規(guī)律。三者的增長趨勢基本上是同步的,對照組中3種分子的水平變化均不明顯。在誘癌組中,誘癌初期,即第8周前Shh基因表達(dá)增加,編碼過多的Shh配體,使得其與稍弱增強表達(dá)的Ptch受體結(jié)合,Smo的抑制作用被解除,整條Hedgehog信號通路被激活,隨著化學(xué)誘癌劑的繼續(xù)作用,三者表達(dá)量顯著增加,彼此相互作用,發(fā)揮著正性調(diào)控的作用,致使誘癌達(dá)到20周時成功誘發(fā)小鼠肝癌,表達(dá)最盛。
綜上所述,正常對照組小鼠肝組織中Shh、Ptch和Smo表達(dá)量低而未被檢測出,而在化學(xué)誘癌組中Hedgehog信號通路在誘癌的早期就已經(jīng)被激活,其成員Shh、Ptch和Smo表達(dá)量的持續(xù)增加所形成的微環(huán)境的不斷變化調(diào)控著小鼠肝癌的發(fā)生、發(fā)展全過程,但確切的調(diào)控機制還有待于進(jìn)一步深入研究,以及與肝癌中其他信號通路之間的共同調(diào)控作用機制也需要做進(jìn)一步的探索。本研究模擬人體肝癌模型,對Shh、Ptch和Smo在小鼠肝癌的始動發(fā)生到形成肝癌的過程中的動態(tài)變化規(guī)律的闡述,為將來開展基因工程藥物的研究和肝癌的靶向治療打下良好的基礎(chǔ)。
1 Llovet JM,Burrough A,Bruix J.Hepatocellular carcinoma[J].Lancet,2003,362(9399):1907-1917
2 Page JM,Harrison SA.NASH and HCC[J].Clin Liver Dis,2009,13(4):631-647
3 Cheng WT,Xu K,Tian DY,et al.Role of Hedgehog signaling pathway in proliferation and invasiveness of hepatocellular carcinoma cells[J].Int J Oncol,2009,34(3):829-836
4 唐超莉,匡志鵬,楊帆.β-catenin在小鼠化學(xué)肝癌形成過程中的動態(tài)變化[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013,21(6):1204-1208
5 Chen X,Horiuchi A,Kikuchi N,et al.Hedgehog signal pathway is activated in ovarian carcinomas correlating with cell proliferation:It's inhibition leads to growth suppression and apoptosis[J].Cancer Sci,2007,98(1):68-76
6 Shen Y,Cao D.Hepatocellular carcinoma stem cells:origins and roles in hepatocarcinogenesis and disease progression[J].Front Biosci:Elite Ed,2012,4:1157-1169
7 Caro I,Low JA.The role of the hedgehog signaling pathway in the development of basal cell carcinoma and opportunities for treatment[J].Clin Cancer Res,2010,16(13):3335-3339
8 Martin J,Donnelly JM,Houghton J,et al.The role of sonic hedgehog reemergence during gastric cancer[J].Dig Dis Sci,2010,55(6):1516-1524
9 Walter K,Omura N,Hong SM,et al.Overexpression of smoothened activates the sonic hedgehog signaling pathway in pancreatic cancerassociated fibroblasts[J].Clin Cancer Res,2010,16(6):1781-1789
10 Sicklick JK,Li YX,Melhem A,et al.Hedgehog signaling maintains resident hepatic progenitors throughout life[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2006,290(5):G859-G870
11 Tian F,Mysliwietz J,Ellwart J,et al.Effects of the Hedgehog pathway inhibitor GDC-0449 on lung cancer cell lines are mediated by side populations[J].Clin Exp Med,2012,12(1):25-30