虞 琳 朱麗君 張怡靜 葉樂(lè)平

支氣管哮喘(以下簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘，asthma)是一種伴有細(xì)胞因子產(chǎn)生異常及氣道內(nèi)變態(tài)反應(yīng)性炎癥發(fā)生的免疫失衡性疾病，即Th1/Th2失衡［1］。多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與哮喘的發(fā)病機(jī)制，其中白介素13(IL-13)激活的 Janus激酶(janus kinases，JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)通路是哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要通路之一，在促進(jìn)哮喘炎癥、黏液高分泌中發(fā)揮重要作用，也是目前的研究熱點(diǎn)［2］。麻杏石甘湯(maxingshigan decoction，MGD)出自我國(guó)國(guó)粹《傷寒論》，因其有辛涼宣肺、止咳平喘之功，在歷史上應(yīng)用已久?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其不僅有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、解熱的功效，還能抗炎、抗過(guò)敏、抗病原微生物以及改善血液循環(huán)。但其在哮喘治療中的具體機(jī)制仍未明確，為其臨床應(yīng)用帶來(lái)一定的局限性。因此，本研究擬通過(guò)建立哮喘大鼠模型，研究IL-13、STAT6、黏蛋白表達(dá)，來(lái)探討麻杏石甘湯抑制氣道炎癥、減少黏液分泌的可能機(jī)制。

材料與方法

1．藥物及試劑:卵清白蛋白(ovalbumini，OVA)、焦磷酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司，大鼠IL-12、IL-13 ELISA試劑盒來(lái)自美國(guó)R＆D公司，STAT6兔抗大鼠多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(Lot#GR52323-3)，二步法免疫組化檢測(cè)試劑、DAB顯色試劑盒、蘇木素染液均購(gòu)自北京中衫金橋，AB-PAS染色試劑盒購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，其余試劑為市售分析純?cè)噭?/p>

2．MGD 的制備:麻黃6g、杏仁6g、甘草5g、石膏 20g(購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院)，MGD的煎制參照中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》。煮石膏20min，將雙蒸水浸泡0．5h后的麻黃、杏仁、甘草放入同煎15min，取第1道汁后再加入雙倍雙蒸水，煎15min，取汁，混合第1、2道汁，濃縮至相應(yīng)體積。高、中、低劑量中藥組分別含生藥24．6、12．3和6．15g/kg。于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理:SPF級(jí)幼年雄性SD大鼠55只(購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重120～180g，隨機(jī)分為5組:對(duì)照組(A組)、哮喘組(B組)、哮喘+高劑量MGD組(C組)、哮喘+中劑量MGD組(D組)、哮喘+低劑量MGD組(E組)，每組11只。哮喘模型的制作分致敏和激發(fā)兩階段。致敏階段:B組分別于第1天和第8天注射卵含白蛋白(OVA)和氫氧化鋁凝膠的無(wú)菌抗原液，A組用等量的生理鹽水替代。激發(fā)階段:第2次致敏1周后，將B～E組哮喘大鼠放入自制的密閉有機(jī)玻璃箱(40cm×30cm×20cm)中，含1%OVA的生理鹽水霧化吸入，每天1次，每次30min，連續(xù)定時(shí)激發(fā)3天;A組用生理鹽水代替OVA進(jìn)行。C～E組在第2次致敏后第4天開(kāi)始分別予高、中、低劑量MGD灌胃，每天2次，激發(fā)階段則每次激發(fā)前后4h灌胃同等劑量MGD。

4．標(biāo)本的制備:末次激發(fā)24h后腹腔注射10%水合氯醛3ml/kg，后行腹主動(dòng)脈切開(kāi)取血處死。即刻切開(kāi)氣管，切取左肺脫水、石蠟包埋，切片后行HE染色、免疫組化、AB-PAS染色。經(jīng)氣管插管行右肺灌洗，留取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，2000r/min離心15min，取上清-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5．BALF中IL-12和 IL-13濃度測(cè)定:應(yīng)用 sandwich ELISA法檢測(cè)BALF中IL-12、IL-13的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)過(guò)程參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

6．免疫組化法:石蠟切片脫蠟至水，高壓修復(fù)3min，室溫冷卻后PBS沖洗，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，先后予蒸餾水、PBS沖洗后，5%山羊血清封閉非特異性抗體，37℃水浴箱孵化30min，滴加 STAT6兔抗鼠多克隆抗體(1∶100)，4℃過(guò)夜;復(fù)溫后滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵化30min;PBS沖洗后行DAB染色，鏡下觀察顯色反應(yīng)，蒸餾水中終止反應(yīng)后予蘇木素復(fù)染，PBS返藍(lán)后脫水、透明，中性樹(shù)膠封片。陽(yáng)性結(jié)果呈棕黃色，用圖像分析儀IPP6．0測(cè)定肺組織平均吸光度值(IOD)作為STAT6蛋白免疫組化檢測(cè)及定量測(cè)定相對(duì)含量。

7．AB-PAS法檢測(cè)氣道黏蛋白表達(dá):石蠟切片脫蠟至水，3%醋酸水溶液室溫1min，1%Alcian blue染色液染色15min，蒸餾水洗后1%過(guò)碘酸氧化8min，Schiff染色12min，水洗后脫水封片。硫酸化黏液呈黑色，酸性黏液呈藍(lán)色，中性黏液呈紅色。檢測(cè)方法同免疫組化。

8．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 17．0，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組樣本均數(shù)比較采用方差分析(one-way ANOVA)，方差齊者兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Tamhane's T2檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．哮喘模型的生物學(xué)判斷:哮喘組大鼠OVA霧化激發(fā)時(shí)多表現(xiàn)為煩躁不安、呼吸急促、四肢顫動(dòng)、毛色失去光澤，嚴(yán)重者四肢癱軟，俯伏不動(dòng)，呼吸節(jié)律不規(guī)則。不同劑量MGD組大鼠激發(fā)后表現(xiàn)均較哮喘組明顯減輕。

2．大鼠 BALF中 IL-12、IL-13(圖1):哮喘組BALF中IL-13濃度顯著高于A組，不同劑量MGD組中該值均較B組低且呈劑量相關(guān)性，其中C、D組與B組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。與A組相比，IL-12在B組含量明顯下降，而采用MGD干預(yù)后BALF中IL-12含量呈濃度依賴(lài)性升高。

3．大鼠肺組織病理改變(圖2):A組大鼠氣道、血管形態(tài)規(guī)整，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。B組氣道、血管肌層明顯增生，周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)明顯，以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主，基膜增厚，部分氣道上皮脫落，管腔內(nèi)可見(jiàn)黏液栓。C～E組肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管平滑肌增生均較B組減輕，且隨著劑量的增加，改善越顯著。

4．MGD對(duì)STAT6表達(dá)的影響(圖3、表1):B組肺組織STAT6蛋白在各級(jí)氣管、支氣管上皮呈棕黃色強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，血管和肺間質(zhì)未見(jiàn)明顯表達(dá)，而A組肺組織中STAT6蛋白呈陰性或極小部分弱陽(yáng)性表達(dá)，其含量顯著低于B組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。MGD明顯下調(diào)哮喘大鼠肺組織氣道上皮的STAT6含量，但高于A組，且C、D組STAT6表達(dá)較B組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

圖1 MGD對(duì)哮喘大鼠BALF中IL-12、IL-13的影響

圖2 氣道炎癥病理學(xué)變化(HE染色，×400)

圖3 大鼠氣道上皮STAT6表達(dá)(免疫組化，×400)

5．MGD對(duì)黏蛋白表達(dá)的影響(圖4、表1):運(yùn)用AB-PAS染色法發(fā)現(xiàn)，B組氣道上皮黏蛋白表達(dá)較A組明顯增多(P＜0．01)，尤以大氣道為著。MGD能明顯減少氣道黏蛋白的表達(dá)，與B組相比，各組大鼠氣道上皮黏蛋白含量均顯著降低(P＜0．05)。

圖4 哮喘大鼠氣道上皮黏蛋白表達(dá)(AB-PAS法，×400)

表1 各組大鼠氣道上皮STAT6、黏蛋白的吸光度(IOD)檢測(cè)(±s)

表1 各組大鼠氣道上皮STAT6、黏蛋白的吸光度(IOD)檢測(cè)(±s)

與 A 組比較，*P ＜0．05，與 B 組比較，△P ＜0．05

組別 STAT6黏蛋白A組0．176 8 ±0．0406 0．169 2 ±0．0230 B 組 0．248 6 ±0．0409* 0．230 9 ±0．0335*C 組 0．205 5 ±0．0316△ 0．181 6 ±0．1796△D 組 0．219 6±0．0220＊△ 0．184 8±0．0262＊△E 組 0．229 6 ±0．0355* 0．204 3 ±0．0277＊△

討 論

隨著哮喘發(fā)生率的逐年攀升，對(duì)其機(jī)制的研究也日漸深入。多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與哮喘的發(fā)病，分別介導(dǎo)著細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和黏附因子在哮喘發(fā)病中的作用。其中IL-13激活的JAK/STAT通路是哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要通路之一，也是目前的研究熱點(diǎn)，因此本研究選擇該通路作為切入點(diǎn)［2］。而氣道黏液高分泌不僅導(dǎo)致氣流受限，還增加氣道反應(yīng)性，過(guò)度的黏液分泌提示哮喘控制不佳，是許多哮喘患兒的共同臨床特點(diǎn)，與發(fā)病率和病死率的升高相關(guān)。

STAT家族成員參與許多細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是整個(gè)JAK/STAT信號(hào)通路的核心分子，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在全身多系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)7個(gè)STAT亞型，其中STAT6與哮喘關(guān)系最為密切。目前認(rèn)為“Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答”是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而筆者前期研究［3］表明，STAT6是誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在Th2細(xì)胞的分化中起著關(guān)鍵性作用。IL-13被認(rèn)為是與哮喘發(fā)病最為直接相關(guān)的Th2因子之一，它參與哮喘的氣道炎癥和重塑，包括黏液分泌，IgE合成，EOS招募，氣道成纖維細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞增殖［4］。有研究認(rèn)為IL-13/STAT6信號(hào)通路通過(guò)增強(qiáng)氣道高反應(yīng)、促進(jìn)炎癥發(fā)生而在哮喘發(fā)病中起著關(guān)鍵作用［5］。本研究中哮喘組氣道上皮STAT6表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，其肺組織周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)顯著，BALF中IL-13濃度高于對(duì)照組，提示哮喘大鼠在變應(yīng)原激發(fā)下STAT6高表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)其下游炎癥因子IL-13等Th2因子大量生成，使Th1/Th2失衡，從而在哮喘發(fā)病中發(fā)揮作用。

氣道黏液是人體呼吸道的第1道防御屏障，是一種由脂質(zhì)、糖結(jié)合物和蛋白質(zhì)組成的溶液，起到屏障、濕潤(rùn)、運(yùn)輸、免疫的作用［6，7］。氣道黏液中含有 2%的黏蛋白(mucin)，由特異性的MUC所編碼。在目前已知的20種人類(lèi)MUC中，只有MUC5AC和MUC5B編碼正常人氣道分泌物中的黏蛋白［8］。MUC5B是人和小鼠小氣道基底層的主要凝膠形成黏蛋白，以發(fā)揮清除功能為主，從而維持氣道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，MUC5AC則是氣道炎癥時(shí)被上調(diào)的主要黏蛋白。在各種原因所導(dǎo)致的氣道炎癥如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘等中，黏蛋白分泌明顯增高，且持續(xù)的黏液高分泌可導(dǎo)致氣道阻塞、氣流受損、肺功能進(jìn)行性下降、細(xì)菌感染機(jī)會(huì)增加等。與COPD相比，哮喘患者的氣道黏液更為黏稠，易產(chǎn)生凝膠狀的黏液栓并可能阻塞氣道［9］。Kondo等［8］發(fā)現(xiàn)使用 IL-13 處理后杯狀細(xì)胞含量增加10倍，提示IL-13能夠刺激杯狀細(xì)胞化生、黏蛋白形成。Tyner等［10］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用IL-13干預(yù)氣-液交界面的小鼠氣道上皮細(xì)胞時(shí)，能誘導(dǎo)纖毛細(xì)胞向杯狀細(xì)胞化生。另有研究發(fā)現(xiàn)肺組織STAT6是黏膜分泌的關(guān)鍵性調(diào)控因子，氣道黏膜分泌功能與STAT6的表達(dá)與激活有關(guān)。江德鵬等［11］用IL-13刺激HBE16細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)MUC5AC和p-JNK1/2表達(dá)升高，使用SP600125阻斷JNK通路后，MUC5AC表達(dá)減弱，認(rèn)為IL-13通過(guò)JNK-STAT6-FOXA2通路調(diào)控黏液分泌。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)哮喘組氣道上皮黏蛋白(主要是大氣道)、STAT6表達(dá)均較對(duì)照組明顯增多，提示STAT6可能通過(guò)誘導(dǎo)大量IL-13產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)氣道杯狀細(xì)胞化生和黏液分泌，引起一系列病理生理改變，從而參與哮喘氣道黏液高分泌的發(fā)生。但本實(shí)驗(yàn)僅能說(shuō)明哮喘時(shí)IL-13、STAT6、黏蛋白均升高，其具體信號(hào)通路的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

近年來(lái)中西醫(yī)聯(lián)合治療兒童哮喘受到越來(lái)越多學(xué)者的重視。支氣管哮喘屬中醫(yī)“哮證”范疇，為冷哮、熱哮。MGD出自漢代醫(yī)圣張仲景的《傷寒論》，由麻黃、杏仁、炙甘草、石膏4味藥組成，具有辛涼宣肺、清熱平喘的功效，是治療熱哮的良方。麻黃和石膏共為君藥，杏仁降利肺氣而平喘，為臣藥;炙甘草益氣和中，為使藥。作為國(guó)粹的經(jīng)典偏方，其在臨床中的應(yīng)用由來(lái)已久?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)MGD中麻黃所含的麻黃堿為 β2受體激動(dòng)劑，可活化腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)，舒張支氣管平滑肌痙攣;杏仁所含的苦杏仁苷經(jīng)酶水解后產(chǎn)生氫氰酸，可使呼吸運(yùn)動(dòng)趨于安靜而奏止咳平喘作用，并能促進(jìn)動(dòng)脈壁前列腺I(mǎi)2(PGI2)樣物質(zhì)生成，擴(kuò)張微血管，改善微循環(huán);生石膏的成分主要為含水硫酸鈣對(duì)支氣管神經(jīng)肌肉有抑制及鎮(zhèn)靜作用，加上鈣質(zhì)能降低支氣管通透性，故有解除支氣管痙攣的作用［12］。但其對(duì)哮喘氣道黏液高分泌的影響及其通過(guò)哪種信號(hào)通路其作用國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。

本研究結(jié)果證明MGD能減少哮喘大鼠EOS浸潤(rùn)，減輕變態(tài)反應(yīng)。而運(yùn)用AB-PAS染色法發(fā)現(xiàn)，MGD組大鼠氣道上皮黏蛋白分泌明顯少于哮喘組，且呈濃度依賴(lài)性，提示MGD能減輕哮喘的黏液高分泌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠在不同濃度MGD灌胃后，氣道上皮STAT6、BALF中IL-13含量均呈劑量相關(guān)性下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Lee等［2］相符。因此筆者推測(cè)哮喘黏液高分泌與IL-13/STAT6通路密切相關(guān)，MGD可能通過(guò)減少炎癥介質(zhì)IL-13、下調(diào)STAT6的表達(dá)，進(jìn)而減少EOS的浸潤(rùn)，減輕氣道炎癥反應(yīng)，降低了哮喘的氣道黏液高分泌。但也有研究認(rèn)為，哮喘大鼠黏液高分泌是通過(guò)獨(dú)立的ERK/PKC通路起作用［13］。因此其具體信號(hào)通路及相關(guān)炎癥因子，MGD的具體制劑、濃度等還有待更進(jìn)一步的研究。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)MGD能減少哮喘大鼠IL-13、STAT6、黏蛋白的表達(dá)，可能通過(guò) IL-13/STAT6/黏蛋白通路減輕炎癥反應(yīng)，減少黏液分泌，為其現(xiàn)代臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。相信隨著哮喘機(jī)制的進(jìn)一步深入研究，臨床MGD片劑、STAT6抑制劑等的研發(fā)，將為哮喘的中西醫(yī)結(jié)合治療開(kāi)辟新的途徑。

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