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環(huán)化小檗堿類似物A55的抗腫瘤活性及其機(jī)制研究

2014-01-29 10:06:08趙午莉李陽(yáng)彪何紅偉宋丹青邵榮光
醫(yī)學(xué)研究雜志 2014年5期
關(guān)鍵詞:異構(gòu)酶小檗衍生物

趙午莉 李陽(yáng)彪 何紅偉 宋丹青 邵榮光

小檗堿(berberine)又叫黃連素,為中藥黃連中的主要生物堿。有多種藥理作用,臨床主要用于清熱、解毒、抗腸道細(xì)菌抗感染以及糖尿病的治療[1~3]。近年研究發(fā)現(xiàn)小檗堿(BBR)還具有抗腫瘤活性,體內(nèi)外的抗腫瘤活性檢測(cè)表明其能夠特異性地抑制白血病、黑素瘤、表皮樣癌、肝癌、口腔癌、惡性膠質(zhì)瘤等癌細(xì)胞的增殖而不影響正常細(xì)胞的生長(zhǎng)[4~8]。本研究所在長(zhǎng)期進(jìn)行小檗堿類衍生物的研究中,基于對(duì)相關(guān)有機(jī)反應(yīng)的深刻理解,合成并構(gòu)建了一類未見(jiàn)報(bào)道的全新化合物結(jié)構(gòu)——環(huán)化小檗堿(CBBR),即在BBR分子中又駢合了一個(gè)芳香環(huán)。結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)CBBR不但與另一類具有顯著抗癌作用的生物堿——苯駢菲里啶類化合物結(jié)構(gòu)相似,而且本身還具備BBR的分子結(jié)構(gòu),因此我們推測(cè)CBBR有可能為一類具有較強(qiáng)抗腫瘤作用的化合物,初步研究結(jié)果表明其對(duì)HCT116細(xì)胞的IC50為1.0μmol/L左右。基于此,筆者以CBBR為先導(dǎo)化合物較為系統(tǒng)地合成了30個(gè)化合物并對(duì)其抑瘤率進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CBBR的8-位經(jīng)基進(jìn)行芳香?;?,引入鄰氟苯甲酰基合成的化合物A55具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性,因此我們著重對(duì)A55的抗腫瘤活性以及其相應(yīng)機(jī)制做了進(jìn)一步的研究[9]。

材料與方法

1.細(xì)胞系及化合物:人肝癌細(xì)胞系 HepG2、SMMC7721、BEL7402、BEL7404、人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7,人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及人大腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29由本實(shí)驗(yàn)室保存;環(huán)化小檗堿及合成的相應(yīng)衍生物A10~A50由筆者單位合成,結(jié)構(gòu)及其合成路線見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]。

2.主要試劑:RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO);新生胎牛血清(Hyclone公司);SRB(sulforhodamine B,Sigma公司);PI(propidium iodide,Sigma公司);預(yù)染蛋白Marker(New England Biolabs公司);DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(Topgen);質(zhì)粒pBR322DNA(Takara);兔抗人抗體p-ATM、r-H2AX和Cleaved Parp等抗體購(gòu)自Cell Signal Technology公司。

3.化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率及IC50的測(cè)定:在96孔板上孔接種不同的腫瘤細(xì)胞,24h后采用不同濃度的化合物進(jìn)行增殖抑制實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖48h后,用50%三氯乙酸 (TCA)固定,并用SRB(0.4%)稀醋酸溶液染色。室溫靜置10min,未與細(xì)胞結(jié)合的SRB用1% 稀醋酸溶液5遍,空氣干燥。結(jié)合的SRB用10mmol/L非緩沖Tris堿液(pH值10.5)振蕩溶解,酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光吸收,測(cè)定波長(zhǎng)為492nm。根據(jù)各孔OD值計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率。計(jì)算公式為抑制率(%)=(1-化合物OD492/對(duì)照OD492)×100%。采用Sigmaplot計(jì)算化合物的IC50。

4.流式細(xì)胞儀測(cè)定方法:用0.2μg/ml的化合物A55處理HepG2細(xì)胞,分別在0、4、8、12和24h收集藥物處理后的細(xì)胞,PBS洗兩次,加入預(yù)冷的75%乙醇,-20℃固定過(guò)夜,離心除去乙醇,PBS洗兩次,加入200μg/ml的RNA酶,37℃消化30min,加碘化丙啶(PI)25μg/ml,4℃避光染色30min后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化[10]。

5.拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制實(shí)驗(yàn):將1U撲異構(gòu)酶Ⅰ和不同濃度的藥物在37℃反應(yīng)20min,再加入0.5μg的pBR322DNA在37℃繼續(xù)反應(yīng) 30min,加入 0.5% 的 SDS,0.25μg/μl的溴酷蘭,15%的甘油終止反應(yīng)。在TBE電泳緩沖液中進(jìn)行瓊脂糖電泳,40V電壓下,電泳4h。溴化乙淀溶液染色30min,置于紫外線下觀察DNA的電泳區(qū)帶,并攝片記錄。

6.Western blot:將 A55加入到 HepG2細(xì)胞中,使A55的終濃度達(dá)到1μg/ml,24h后取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液,提取細(xì)胞總蛋白,蛋白定量后加熱變性。每組取40μg蛋白經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳分離后,采用半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2h,加入一抗 (1∶1000)4℃ 孵育過(guò)夜,采用TBST洗膜5次,加入HRP標(biāo)記二抗(1∶5000),室溫下孵育1h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光顯色。以β-actin作為內(nèi)參。

結(jié) 果

1.化合物 A55的抗腫瘤活性篩選:首先采用HCT116細(xì)胞對(duì)先導(dǎo)化合物CBBR及其30個(gè)衍生物(A10~A50)的抗腫瘤活性進(jìn)行篩選,篩選濃度為3μg/ml。結(jié)果表明有15個(gè)化合物的抑制率達(dá)到了85%以上。接著采用0.5μg/ml的濃度對(duì)這15個(gè)化合物繼續(xù)篩選。結(jié)果表明,化合物A55的抑制率最高,達(dá)到了90%左右,化合物A32和A45的抑制率分別為62%和68%,高于其他化合物。對(duì)化合物A55、A32和A45的IC50進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明其IC50分別為0.18 ±0.01、0.46 ±0.03 和 0.4 ±0.05μg/ml,A55 的活性最高。此后筆者選用A55(圖1)對(duì)具其抗腫瘤活性進(jìn)行了進(jìn)一步的研究并初步探討了其抗腫瘤機(jī)制。

2.A55對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用:筆者采用 BEL7402、BEL7404 SMC7721、HT29、A549 以及MCF-7等腫瘤細(xì)胞對(duì)環(huán)化小檗堿CBBR及其衍生物A55的IC50進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明A55對(duì)多種類型的腫瘤均具有良好的抑制作用,抑制效果明顯強(qiáng)于先導(dǎo)化合物CBBR,結(jié)果見(jiàn)表1和圖2。

圖2 A55對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系的IC50

3.A55對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ具有較強(qiáng)的抑制作用:TopⅠ在體外可使DNA雙鏈中的單鏈斷裂,使另一單鏈從缺口處穿過(guò),催化超螺旋的DNA松弛解旋。本實(shí)驗(yàn)中A55對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的解螺旋活性抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,A55在和pBR322DNA以及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ共同孵育時(shí),可完全逆轉(zhuǎn)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ對(duì)底物pBR322DNA的解螺旋作用,而其直接和底物pBR322DNA作用時(shí),pBR322DNA并無(wú)明顯的改變,因此我們認(rèn)為A55可有效地抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ活性(圖3)。

4.A55可將細(xì)胞周期阻滯于S期:為了進(jìn)一步探化合物 A55的抗腫瘤機(jī)制,筆者檢測(cè)了 A55對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果表明,化合物A55作用于HepG2細(xì)胞4h后,細(xì)胞的周期開始阻滯于S期,并隨著時(shí)間的增加,S期阻滯不斷加強(qiáng),到24h,阻滯達(dá)到最強(qiáng)(圖4)。

圖3 A55對(duì)TopⅠ的抑制作用

圖4 A55對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響

5.A55通過(guò)促進(jìn) DNA鏈斷裂引起凋亡:由于A55抑制了拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性,阻止了DNA斷端的再連接,引起了DNA斷裂和細(xì)胞凋亡。因此我們檢測(cè)了A55處理細(xì)胞后細(xì)胞的凋亡以及與凋亡和DNA斷裂相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明,A55可明顯引起HepG2細(xì)胞凋亡(圖5A),如細(xì)胞核濃縮、碎裂及溶解等現(xiàn)象。Western blot結(jié)果表明,在A55作用于HepG2細(xì)胞24h后,與DNA斷裂相關(guān)的蛋白p-ATM和 γ-H2AX明顯增加,凋亡相關(guān)蛋白cleaved parp和cleaved caspase-3明顯增加(圖5B)。

圖5 A55引起細(xì)胞凋亡并激活DNA修復(fù)通路

討 論

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ是一種核酶,可松解DNA超螺旋,在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等重要過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞中TopⅠ的含量和活性要明顯高于正常細(xì)胞,如果能選擇性抑制TopⅠ的生理作用,便能有效抑制腫瘤細(xì)胞的DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,從而引起細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[11]。因此,TopⅠ成為抗腫瘤藥物作用的重要靶點(diǎn)。目前在臨床使用和處于研發(fā)階段的TopⅠ抑制劑主要包括喜樹堿類(camptochecines)和吲哚并咔唑類(indolocarbazoles)等化合物但由于水溶性差、不良反應(yīng)強(qiáng)以及耐藥使得這些藥物的應(yīng)用受到了限制,因此開發(fā)結(jié)構(gòu)新且藥效強(qiáng)的新型抗腫瘤藥物非常重要[12]。Li等[13]報(bào)道小檗堿能與TopⅠ結(jié)合,使S期細(xì)胞合成受阻,阻止細(xì)胞增殖。CBBR是一類全新結(jié)構(gòu)骨架的化合物——環(huán)化小檗堿,由于其具有更好的平面性結(jié)構(gòu)特征,更加容易嵌入雙鏈DNA堿基對(duì)里,推測(cè)可能具有更好的抗腫瘤作用。采用HepG2細(xì)胞對(duì)CBBR 的 IC50檢測(cè),IC50在 1.2μmol/L 左右,活性顯著強(qiáng)于BBR[9]。A55是在CBBR結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造而形成的一類衍生物,即在CBBR的8-位經(jīng)基進(jìn)行芳香?;?,引入鄰氟苯甲?;?。改造后的 A55對(duì)HCT116的抗腫瘤活性顯著強(qiáng)于 CBBR,IC50達(dá)到了0.18μg/ml,對(duì)其他腫瘤的結(jié)果也表明其 IC50在1μg/ml左右,顯示了良好的抗腫瘤活性。

在DNA復(fù)制過(guò)程中,拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ在DNA雙鏈上產(chǎn)生單鏈斷裂,使另一單鏈從缺口處穿過(guò),使得DNA從超螺旋變?yōu)槭杷尚?,進(jìn)而一些與DNA復(fù)制相關(guān)的酶結(jié)合到DNA上,啟動(dòng)了染色體的復(fù)制。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑與拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合后抑制了DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的催化活性,使得斷裂的DNA不能重新進(jìn)行連接,進(jìn)而導(dǎo)致 DNA鏈發(fā)生致命性的破壞,造成DNA損傷,從而激活DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)及相應(yīng)的DNA損傷應(yīng)答修復(fù)通路(DNA damage response,DDR)進(jìn)行修復(fù)[14,15]。這些通路包括細(xì)胞內(nèi)的感應(yīng)器如 ATM的快速識(shí)別損傷,啟動(dòng)下游多種效應(yīng)成分如H2AX及引起周期阻滯的蛋白通路,提供時(shí)間進(jìn)行損傷修復(fù)。其中最為顯著和具有標(biāo)志意義的是H2AX的磷酸化,如損傷不能正確修復(fù)或不能修復(fù),凋亡和非凋亡性死亡(apoptosisand non-apoptoticdeath)程序?qū)⒈粏?dòng)[16]。環(huán)化小檗堿衍生物A55在和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ以及底物DNA共同作用時(shí)可顯著抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的解螺旋作用,但其單獨(dú)和超螺旋DNA反應(yīng)并不影響pBR322DNA的構(gòu)型改變,表明A55是通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性來(lái)影響pBR322DNA的構(gòu)型。由于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ活性受到抑制,使得DNA鏈在解旋后不能再連接而引起DNA斷裂,因此我們觀察到與DNA斷裂相關(guān)的蛋白如ATM和H2AX被磷酸化激活。

細(xì)胞在進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí),需要拓?fù)洚悩?gòu)酶來(lái)解螺旋并在DNA復(fù)制結(jié)束后再改變雙鏈DNA拓?fù)湓傩纬沙菪虼送負(fù)涿冈诩?xì)胞的S期的活性和表達(dá)量最高,因此,當(dāng)拓?fù)涿甘艿揭种茣r(shí),細(xì)胞的DNA復(fù)制過(guò)程會(huì)嚴(yán)重受阻并使得細(xì)胞可能停滯在S期。本實(shí)驗(yàn)中,化合物A55通過(guò)主要通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性而引起的DNA損傷的修復(fù),周期分布實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了細(xì)胞停滯在S期,這也同樣與通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性而致DNA損傷的羥基喜樹堿衍生物引起的S期阻滯是一樣的[17]?;衔顰55具體是通過(guò)激活或抑制了哪些通路而導(dǎo)致了S期阻滯,今后我們也將進(jìn)一步進(jìn)行研究。腫瘤細(xì)胞在A55的持續(xù)作用下,由于修復(fù)不能完全進(jìn)而活化了促使細(xì)胞凋亡的一系列酶如csapase-3,活化后的 csapase-3裂解了parp從而最終引起細(xì)胞凋亡。

總之,環(huán)化小檗堿衍生物A55是一類鏢靶明確、結(jié)構(gòu)新穎以及抗腫瘤活性強(qiáng)的新型抗腫瘤化合物,且本所可以自主合成開發(fā)。隨著對(duì)其作用機(jī)制研究的逐漸深入,這一類從生物堿中發(fā)現(xiàn)高效低毒的抗腫瘤新藥的前景將會(huì)更加廣闊。

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