劉紅，姜偉，劉煒，楊煥興，韋吉崇，啟冠軍，雷愛娜，鐘晴，劉楠楠，鄧蘇夢，王凱悅

（海南師范大學(xué)海口市熱帶特色藥食同源植物研究與開發(fā)重點實驗室，海南海口571127）

明日葉Angelica keiskei 別名明日草[1]、八丈草，含有人體所必需的各種維生素、礦物質(zhì)，其根莖中含有豐富的天然黃酮（flavonoid）和香豆素（Coumarin），這些物質(zhì)具有抗菌、抗癌作用。通常認(rèn)為，脫氧核糖核酸（DNA）是重要的遺傳物質(zhì)，與藥物分子的相互作用會影響到DNA 轉(zhuǎn)錄和翻譯[2]，從而引起活細(xì)胞的物理化學(xué)性質(zhì)和生理功能的改變，起到抗癌[3]或者藥效作用，因此眾多學(xué)者開始致力于研究藥物分子與DNA 的相互作用。目前，通常對藥物分子通過溝槽或是嵌插結(jié)合在核酸的螺旋溝或堿基中，誘發(fā)許多生物效應(yīng)，阻礙核酸信息的正常表達(dá)，特別是嵌插作用，或直接抑制DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能；或在經(jīng)過進(jìn)一步活化后，使DNA 斷裂受損而影響其功能。研究藥物小分子與DNA 的相互作用機制，有利于了解藥物的作用機理，進(jìn)而為新藥設(shè)計和篩選提供有價值的信息[4]。有關(guān)明目葉根的黃酮類化合物與DNA 相互作用的光譜分析尚未見報道，本文通過對明日葉根某些黃酮類化合物與DNA 相互作用機制的研究，旨在為明日葉藥理活性的研究和利用提供有價值的信息，同時對高效、低毒天然藥物的設(shè)計與開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜儀：大連依利特分析儀器有限公司；RF-5301 熒光分光光度儀：日本島津公司；明日葉根：青島開源集團環(huán)保工程有限公司；鯡魚：DNA Sigma 公司；薄層色譜板Kieselgel 60 F254：Merck 公司；其余試劑均為分析純。

1.2 明日葉根黃酮的分離與純化

取明日葉根洗凈、粉碎，過100 目篩，分別稱取100 g 粉末按料液比1∶10 的比例加入75%的乙醇，浸泡24 h 后過濾，濾渣用75%的乙醇重新處理三次，合并濾液，得到明日葉根黃酮初提液。用石油醚浸泡12 h，以除去脂溶性物質(zhì)，過濾，得到下層黃色液體，減壓濃縮，得到黃色膏狀提取物，低溫保存。

將明日葉根黃酮膏狀提取物用層析硅膠（100 目）拌樣，經(jīng)正相硅膠柱層析分離，以90%甲醇進(jìn)行梯度洗脫，每10 min 接一次樣，后通過薄層層析色譜追蹤，合并斑點相同的組分，得到（A-G）7 個餾分。

將G 餾分濃縮用層析硅膠（100 目）拌樣，經(jīng)硅膠柱層析用正己烷-乙酸乙酯2∶1 梯度洗脫，每5 min 接一次樣，經(jīng)薄層層析色譜追蹤后合并斑點相同組分得到（G1-7）7 個餾分，取G7 餾分，得到黃酮提取物。

1.3 明日葉根黃酮提取物與DNA 相互作用的光譜研究

1.3.1 DNA 猝滅實驗

在4 個10 mL 容量瓶中，依次分別加入固定量明日葉根黃酮溶液和不同量的DNA 溶液，隨后均加入固定量的pH=7.2 的Tris-HCl 緩沖溶液并用二次蒸餾水定容至刻度，搖勻，在熒光儀上進(jìn)行熒光光譜和吸收光譜的測定。熒光激發(fā)波長為368 nm，發(fā)射波長為450 nm，狹縫寬均為5 nm。

1.3.2 UV-vis 光譜

在4 個10 mL 的容量瓶中，分別加入固定量的Tris-HCl 緩沖溶液和固定量的DNA 溶液，隨后分別加入不同量的明日葉根黃酮溶液并用二次蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置10 min 后進(jìn)行紫外光譜測定。

2 結(jié)果

2.1 明日葉根黃酮提取物對DNA 紫外吸收光譜的影響

一般而言，化合物與DNA 如果存在相互作用就必然會在吸收光譜中有所反映，因為具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA 分子中由于含有芳香性堿基與磷酸生色團而在260 nm 左右存在一強烈的吸收。DNA 的堿基是許多藥物與DNA 作用的位點，藥物與DNA 結(jié)合將引起DNA 特征吸收峰的變化，見圖1。

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，隨著溶液中明日葉根黃酮濃度的逐漸增大，DNA 的紫外吸收光譜出現(xiàn)了增色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象，這種增色效應(yīng)是由于嵌插劑嵌入核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中，并且嵌入劑可在兩個堿基對之間滑動，從而降低了與核酸的超螺旋程度密切相關(guān)的鏈環(huán)數(shù)，使得超螺旋的緊密結(jié)構(gòu)變成較為松馳的狀態(tài)[5]。Long 理論認(rèn)為紅移現(xiàn)象是小分子與DNA 發(fā)生嵌插作用的標(biāo)志，由此可以初步推斷明日葉根黃酮分子可能嵌插進(jìn)DNA 的堿基對中，結(jié)合到DNA 的親核位點，引起了紫外吸收官能團的改變[6-7]。

圖1 不同明日葉根黃酮濃度下的紫外吸收光譜Fig.1 The ultraviolet absorption spectrum of interaction between different concentrations of Angelica keiskei roots flavone

2.2 DNA 存在下明日葉根黃酮提取物的熒光光譜

圖2為DNA 存在下明日葉根黃酮的熒光發(fā)射光譜。

圖2 DNA 存在下明日葉根黃酮提取物的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectrum of interaction between different concentrations of Angelica keiskei roots flavone

從圖2中可以看出，明日葉根黃酮在450 nm（λex=368 nm）處有一最大發(fā)射峰。DNA 的存在可使明日葉根黃酮最大熒光發(fā)射峰的熒光強度發(fā)生猝滅。當(dāng)DNA 濃度逐漸增大時，猝滅程度逐漸增強。表明DNA和明日葉根黃酮可能形成了復(fù)合物。

2.3 猝滅機制

由熒光猝滅的Stem-Volmer 方程：

式中：F0為未加入猝滅劑時熒光物質(zhì)的熒光強度；F 為猝滅劑濃度等于C 時熒光物質(zhì)的熒光強度；KSV 為Stem-Volmer 猝滅常數(shù)[8-10]，（L/mol）。

求出在298 K 時，DNA 對明日葉根黃酮的Stem-Volmer 猝滅常數(shù)KSV 為0.94×103L/mol，同時溫度升高，其KSV 為0.93×103L/mol。如果對動態(tài)猝滅來說，其猝滅常數(shù)隨溫度升高將會升高，因此上述結(jié)果表明DNA 對明日葉根黃酮的熒光猝滅不是由于分子間動態(tài)碰撞，而是靜態(tài)猝滅。

2.4 DNA 與明日葉根黃酮提取物二元絡(luò)合物的組成及其結(jié)合常數(shù)

靜態(tài)熒光強度與猝滅劑的關(guān)系[7]，如公式（2）所示。

式中：F0與F 分別代表未加入和加入DNA 時的熒光強度；K 為明日葉根黃酮與猝滅劑之間的結(jié)合常數(shù)，（L/mol）；C 為猝滅劑DNA 的濃度；n 為結(jié)合位點數(shù)。

由式（2）分別作出明日葉根黃酮-DNA 體系的關(guān)系圖（圖3）。

圖3 25 ℃下明日葉根黃酮-DNA 體系的F0/F-C 工作曲線Fig.3 F0/F-C working curve in the different concentrations of Angelica keiskei Roots flavone and DNA system at 25 ℃

通過斜率和外推截距可以求出明日葉根黃酮與猝滅劑之間的結(jié)合常數(shù)。25 ℃時明日葉根黃酮與DNA之間的結(jié)合常數(shù)為5.35×105L/mol，經(jīng)典插入方式是與結(jié)合DNA 的溴化乙錠的結(jié)合常數(shù)為4.9×105，這說明明日葉根黃酮提取物與DNA 主要以插入方式。

圖4 303 K 和298 K 下明日葉根黃酮-DNA 體系的lg[（F0-F）/F]-lg[C]工作曲線Fig.4 lg（F0-F）/F-lg[C]working curve in the system of Angelica keiskei roots flavone and DNA at 303 K and 298 K

2.6 分子之間作用力的測定

小分子和大分子之間作用力包括氫鍵，范德華力，靜電引力和疏水作用，熱力學(xué)參數(shù)焓變△rHsm，熵變△rSsm和自由能△rGsm決定熱力學(xué)模式，熱力學(xué)有關(guān)參數(shù)計算公式[11]如下：

表1 結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)Table1 Thermodynamics parameters in binding reaction

3 結(jié)論

用熒光法[11]和紫外吸收光譜法研究了DNA 與明日葉根黃酮的相互作用，明日葉根黃酮在450 nm（λex=368 nm）處有一最大發(fā)射峰。DNA 的存在可使明日葉根黃酮最大熒光發(fā)射峰的熒光強度發(fā)生猝滅。當(dāng)DNA濃度逐漸增大時，猝滅程度逐漸增強。

DNA 與明日葉根黃酮之間存在較強的相互作用，25 ℃時結(jié)合常數(shù)為5.35×105L/mol 結(jié)合方式是明日葉根黃酮通過插入方式與DNA 結(jié)合，他們之間主要靠分子之間的氫鍵和范德華力。

[1] 張玉芳.明日葉品質(zhì)管制之研究[D].臺灣:中國醫(yī)藥學(xué)院中國藥學(xué)研究所碩士論文,2001

[2] Diculescu V C,Chiorcea Paquim A M,Oliveira Brett A M.Electrochemical DNA Sensors for Detection of DNA Damage[J].Sensors，2005(5):377-393

[3] Vrána O,Brabec V.Electrochemical analysis of antitumour platinum drugs and their complexes with DNA[J].Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electro-chemistry,1988,253:145-160

[4] 廖見培,黃彬生.DNA 與小分子藥物相互作用研究進(jìn)展[J].化學(xué)傳感器,2005,25(1):1-5

[5] 郭金保,張國文.藥用植物活性成分黃酮類化合物與核酸作用機制的研究[D].南昌大學(xué),2008

[6] 盧繼新,張貴珠,黃志娜,等.巰嘌呤金屬配合物與小牛胸腺DNA的作用[J].化學(xué)學(xué)報,2002,60(6):967-972

[7] 馮喜增,金瑞祥.各種離子對血卟啉與牛血清白蛋白相互結(jié)合反應(yīng)的影響研究[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報,1996,17(6):866-869

[8] 劉煒,畢和平,張連華,等.阿司匹林與DNA 相互作用的光譜研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(15):6837-6838

[9] 段云青,閔順耕.溴鼠靈與DNA 作用機制的光譜研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2009,29(4):999-1003

[10] 鄧勝國,鄧澤元,范亞葦,等.荷葉中紫云英苷和DNA 相互作用的光譜學(xué)研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2010(2):190-194

[11] Zhang S,Ling B,Qu F,et al.Investigation on the interaction between luteolin and calf thymus DNA by spectroscopic techniques [J].Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2012,97:521-525