劉洋,張清平,段文鋒

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院 國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(上海)，上海200233)

0 引 言

雙歧桿菌是能在人和動物腸道內(nèi)定植的益生菌，最早由法國巴斯德研究所Tissier博士于1899年首次從母乳喂養(yǎng)兒的糞便中分離發(fā)現(xiàn)，1924年命名為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)[1]。大量研究表明，雙歧桿菌能抑制致病菌入侵和定植、調(diào)節(jié)機體免疫、降低膽固醇、抑制腫瘤發(fā)生等，在維持機體腸道微生態(tài)平衡和宿主健康方面發(fā)揮著重要的作用。因此，雙歧桿菌成為近年來食品、藥品研究開發(fā)的熱點，部分菌株大量用于嬰幼兒配方食品、保健食品、藥品的生產(chǎn)中。但雙歧桿菌發(fā)揮有益功能具有很強的菌株特異性，為此FAO/WHO益生菌評價指南中指出，精確的菌株識別是益生菌使用的前提[2]，因此，雙歧桿菌的分類鑒定一直是研究的重點和熱點。近年來，分子生物學(xué)方法成為雙歧桿菌分類鑒定的主要手段，本文就目前常用的分子分型鑒定技術(shù)特點和應(yīng)用進展進行介紹。

1 雙歧桿菌屬的分類學(xué)進展

微生物分類是不斷發(fā)展變化的動態(tài)過程，雙歧桿菌也不例外[3-5]。早期的屬水平的鑒別方法都局限于形態(tài)學(xué)和生理生化方法，而雙歧桿菌屬的特征又很多樣化。從發(fā)現(xiàn)到20世紀中期，雙歧桿菌先后被劃入芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、擬桿菌屬、放線菌屬[4]。近30多年，分子生物學(xué)技術(shù)高速發(fā)展，從Scardovi最早利用DNADNA雜交的方法研究雙歧桿菌的分類開始，雙歧桿菌屬的命名從表型進入了遺傳型階段[6]。2004年，Liesbeth等根據(jù)DNA-DNA雜交、擴增片段長度多態(tài)性、atpD及groEL基因序列分析等將乳雙歧桿菌(B.lactis)重新劃分為動物雙歧桿菌乳亞種(B.animalis subsp.lactis)[7]；2008年，Mattarelli等根據(jù)DNA-DNA雜交、16S rDNA及hsp60基因序列分析、隨機擴增長度多態(tài)性、BOXPCR、變性梯度凝膠電泳等數(shù)據(jù)，將長雙歧桿菌(B.longum)重新劃分為3個亞種：長雙歧桿菌長亞種(B.longum subsp.longum)、長雙歧桿菌嬰兒亞種 (B.longum subsp.in fantis)、長雙歧桿菌豬亞種(B.longum subsp.suis)[8]。 2011年，Hidetoshi等發(fā)表了雙歧桿菌屬的一個新種B.kashiwanohense[9]。 2012年，Akihito Endo等發(fā)布了5個新種，B.reuteri,B.callitrichos,B.saguini,B.stellenboschense和B.biavatii[10]。截止目前，該屬包含41個種，9個亞種，模式種為兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)。

2 雙歧桿菌屬的分子分型鑒定方法

目前，根據(jù)分子分型技術(shù)的原理不同主要可分為2大類，分別為基于測序的分型鑒定方法，基于DNA印跡的分型鑒定方法。其中基于測序的方法主要如16S rDNA和16S-23S rDNA間區(qū)序列分析、多位點測序分型方法(Multilocus sequence typing,MLST)?；贒NA印跡的方法又分為2小類，一類為無需PCR而直接根據(jù)基因組序列特征分型，如脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)、限制性片段長度多態(tài)性 分 析 (Restriction fragment length polymorphisms,RFLP)；一類為基于PCR技術(shù)的印跡法，如隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù) (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性分析(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)、rep-PCR方法(Repetitive ExtragenicPalindromic PCR,REP-PCR)。

2.1 基于測序的分型鑒定方法

2.1.1 16S rDNA和16S-23S rDNA ITS序列分析

16S rDNA序列分析是目前細菌分類鑒定中最常用和必須進行的一種鑒定分析方法，能確定細菌的新的分類命名地位。主要步驟包括：基因組DNA提取、16S rDNA的擴增、16S rDNA基因測序和序列分析。將目標序列與基因數(shù)據(jù)庫中16S rDNA序列比對，分析相似度和進化關(guān)系，確定分類地位。一般認為，16S rDNA序列93%～99%的相似度可認為是具有緊密親緣關(guān)系，有別于其他菌屬[11]。Stackebrandt等提出同種的16S rDNA基因序列同源性應(yīng)大于97%，作為種水平的判別標準[6]。雙歧桿菌屬的16S rDNA序列相似度介于87.7%～99.5%之間，部分長雙歧桿菌、動物雙歧相似度達到99%以上，不具備種內(nèi)區(qū)分雙歧桿菌的能力[12]。王濤等利用16S rDNA對人體糞便中分離的1株雙歧桿菌進行鑒定[13]。高鵬飛等利用16S rDNA對從12位健康蒙古族兒童糞便中分離得到11株雙歧桿菌進行鑒定，發(fā)現(xiàn)B.animalis V9與乳雙歧桿菌BB12的同源性為99%，有望在乳制品和保健產(chǎn)品中廣泛應(yīng)用[14]。近年來，二代測序技術(shù)的發(fā)展，使得益生菌菌群分析進行高通量時代。Gulitz等研究者利用基于焦磷酸測序的16S rDNA分析對水開菲爾(water kefir)發(fā)酵飲料進行菌群分析，發(fā)現(xiàn)大量的嗜冷雙歧桿菌(B.psychraerophilum)，針對16S rDNA的高通量測序技術(shù)將成為對發(fā)酵食品菌群進行深度分析的有力工具[15]。

16S rDNA和23S rDNA基因之間的區(qū)域，稱為內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internally transcribed spacer，ITS)，較16S rDNA和23S rDNA進化快，不同菌的序列長度和堿基差異較大，用于區(qū)分和鑒定親緣關(guān)系相近的種和菌株，是目前種及亞種水平鑒定最可信和準確的方法之一。主要步驟為：根據(jù)16S rDNA和23S rDNA末端的保守序列設(shè)計引物、對ITS序列進行擴增、對擴增產(chǎn)物測序并進行序列分析。該方法廣泛用于雙歧桿菌的分類鑒定及多態(tài)性研究中。Francesca等研究者利用16S rDNA和16S-23S ITS序列對人類腸道黏膜和糞便中900個分離菌株進行鑒定，發(fā)現(xiàn)了704株雙歧桿菌，主要有長雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌等6種，在糞便、黏膜等腸道不同環(huán)境中分布有差異[16]。LI等通過表型鑒定、16S rDNA和16S-23S ITS從10株雙歧桿菌中篩選出動物雙歧桿菌乳亞種Qq08菌株，具有耐氧、耐酸和耐膽汁鹽能力，比商業(yè)化益生菌株BB12特性更好[17]。

2.1.2 半保守基因序列分析

除了16S rDNA和16S-23S rDNA ITS序列外，研究者也尋找到其他保守性略低的基因，通過測序分析，對菌種進行有效區(qū)分。如recA基因中一段300 bp的片段，有足夠的信息可用于雙歧桿菌屬大部分種的區(qū)分，還能對相近的種如動物雙桿桿菌乳亞種和動物亞種區(qū)分[18]。 16S rDNA、16S-23S rDNA ITS結(jié)合這些保守基因的序列分析，可在種及亞種水平對雙歧桿菌進行較精確的分型鑒定。Byoung等提出rpoB基因序列相似度84.1%～99.0%時，可以作為雙歧桿菌鑒定的有效分子標簽[19]。Loredana等利用hsp60基因?qū)﹄p歧桿菌進行鑒定，認為該基因具有種及亞種水平的分辨力[20]。Sheu等采用tuf基因引物實現(xiàn)對發(fā)酵乳中雙歧桿菌部分種的分子鑒定[21]。 另外，還有g(shù)roEL，recA，atpD，dnaK，grpE等基因。但是該類單基因分子尚無完善的數(shù)據(jù)庫，不足以提供全面的進化分析信息，菌株水平區(qū)分能力不夠；且由于缺乏有效的保守區(qū)域，基于這些基因設(shè)計種特異分型引物存在一定困難。

2.1.3 多位點測序分型

多位點測序分型 (Multilocus Sequence Typing，MLST)技術(shù)是1998年Maiden等提出，近年來發(fā)展較快的一種分子分型方法[22]。它選擇多個編碼蛋白的管家基因，進行序列測定，分析等位基因圖譜，進行聚類分析，根據(jù)位點序列賦予不同菌株序列型(Sequence type，ST)，對菌株進行多位點的精確分型。最早的MLST序列測定450 bp，基因個數(shù)7～10個，具有較好的分辨能力。與其他方法相比，該技術(shù)是標準化的測序技術(shù)；操作簡便，重復(fù)性好；數(shù)據(jù)能共享、動態(tài)補充和互相比較；分型精度可以和PFGE相媲美，達到菌株水平。目前全球共有4個較大的公共MLST數(shù)據(jù)庫(www.pasteur.fr/mlst，http://pubmlst.org/，http://www.mlst.net/，http://mlst.ucc.ie/)。

關(guān)于雙歧桿菌的MLST研究剛剛起步。2006年，Marco等人選擇7個保守的管家基因，clpC，dnaB，dnaG，dnaJ1，purF，rpoC和xfp，對雙歧桿菌常見種的模式菌株進行進化分析，比較7個基因建立的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果比單基因建樹結(jié)果更全面、合理[12]。2010年，Alexis等研究者對119株動物雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌進行clpC、purF等7個管家基因的MLST分析，共獲得104個ST型別，在兩歧雙歧、長雙歧、短雙歧種間區(qū)分度達到99%，具有精確菌株分型的能力[23]。 2011年，Hiroshi利用MLST和AFLP技術(shù)對母體中長雙歧桿菌轉(zhuǎn)移到嬰兒體內(nèi)的過程進行溯源分析[24]。鑒于MLST方法能綜合多個管家基因的進化信息、易于標準化操作等諸多優(yōu)點，有望成為雙歧桿菌進化分析的強有力的工具。

2.2 DNA印跡方法

2.2.1 直接針對基因組的DNA印跡方法

(1)脈沖場凝膠電泳。

脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)是目前菌株鑒定，包括雙歧桿菌鑒定的金標準方法。其操作步驟為：細菌培養(yǎng)后在瓊脂糖凝膠塊中裂解，用稀有酶切位點的內(nèi)切酶作用，脈沖場凝膠電泳分離。DNA帶譜反映了目標基因組特異的序列分布，可以作為分型的依據(jù)。該方法能反映雙歧桿菌全基因組中較多的變異信息，具有重復(fù)性好、分辨率高、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點，比16S rDNA方法分辨力更高，具備菌株水平溯源能力，是菌株多相鑒定技術(shù)的常用方法之一。

PFGE自1996年用于雙歧桿菌的分型鑒定中。2006年，Briczinski等改進了雙歧桿菌PFGE技術(shù)的條件，大大縮短了該方法的操作時間[25]。Marius等對市售益生菌乳制品中的雙歧桿菌進行計數(shù)分析，并用PFGE分析對包括酸乳在內(nèi)的乳制品中雙歧桿菌鑒定，發(fā)現(xiàn)所有分離菌株和BB12等3個商業(yè)菌株譜型一致，均為動物雙歧桿菌，推測不同名稱的商業(yè)菌株可能來源相同[26]。Kheadr等利用PFGE法對14株母乳喂養(yǎng)新生兒體內(nèi)分離的雙歧桿菌進行分子鑒定，16S rDNA技術(shù)發(fā)現(xiàn)這些分離株與thermacidophilum豬亞種有98%-99%的相似性，進一步用PFGE分析將其分為4種酶切圖譜，認為該類亞種在新生兒體內(nèi)的存在將幫助形成嬰兒的腸道生境[27]。Aires等利用PFGE和BOX-PCR對15個嬰兒體內(nèi)動態(tài)收集4次獲得的雙歧桿菌進行分析，發(fā)現(xiàn)不同嬰兒體內(nèi)有不同的雙桿桿菌優(yōu)勢菌種，隨著時間而變化，利用該法可以對嬰兒體內(nèi)雙歧桿菌菌群分布進行動態(tài)分析，用于調(diào)節(jié)嬰兒飲食方案[28]。但PFGE的不足為操作復(fù)雜、步驟繁瑣、需要特殊設(shè)備和易受操作者經(jīng)驗影響，是該法的應(yīng)用限制。

(2)限制性片段長度多態(tài)性分析。

限制性片段長度多態(tài)性分析 (Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP) 于1980年最先提出，是發(fā)展最早的DNA印跡技術(shù)之一。主要步驟為：限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、探針標記特定DNA片段。DNA片段數(shù)目和長度反映了DNA分子上不同酶切位點的分布。是可用于種間鑒定的一種DNA指紋方法。

目前，傳統(tǒng)的RFLP技術(shù)使用較少，常與PCR聯(lián)用，稱為PCR-RFLP。即先針對16S rDNA或其他靶標基因設(shè)計擴增引物，再對擴增片段酶切，從而把不同多態(tài)性的菌株序列區(qū)分開來。該方法既利用了PCR的片段選擇特異性，又發(fā)揮了RFLP對多態(tài)性的分析能力，比單個技術(shù)的分辨力要高。Loredana等建立了一種針對hsp60基因的PCR-RFLP方法，先用引物擴增hsp60基因中一段590 bp的片段，而后用HaeⅢ對擴增產(chǎn)物酶切，能對25個雙歧桿菌不同的種，以及動物雙歧、假長雙歧桿菌的部分亞種進行區(qū)分[20]。還有一種新的非培養(yǎng)的低分辨群落分析技術(shù)也基于RFLP，稱為T-RFLP。該方法在擴增引物的一端加上熒光標記，對目標序列擴增后再酶切，而后用專門的讀圖設(shè)備分析鋒形，與模式菌株純培養(yǎng)制備的鋒形比較，通過軟件的計算獲得混合樣本中的細菌群落分布情況，分型水平到屬或?qū)僖韵?。Fei Sjoberg等利用T-RFLP技術(shù)和培養(yǎng)方法比較分析了部分出生1周到12個月的嬰兒糞便，認為T-RFLP方法對不可培養(yǎng)厭氧菌種的檢測更加穩(wěn)定，為一種靈敏、具備合適區(qū)分力的腸道微生物組成分析方法[29]。

2.2.2 基于PCR的DNA印跡方法

(1)隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)。

隨機擴增多態(tài)性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)技術(shù)是由WILLIAMS和WELSH同時發(fā)展起來的一種DNA標記技術(shù)。其原理是針對目標菌株基因組DNA，以單一的隨機寡核苷酸序列為引物進行PCR擴增，片段經(jīng)凝膠電泳分離后呈現(xiàn)出DNA指紋圖譜，分析基因組多態(tài)性特征對菌株分類鑒定。RAPD技術(shù)可在基因組序列未知的情況下進行，設(shè)計和實驗簡單，在雙歧桿菌鑒定中應(yīng)用廣泛。

董明盛采用RAPD技術(shù)，用10條引物對7種9株雙歧桿菌基因組進行PCR擴增,發(fā)現(xiàn)引物S256對雙歧桿菌種及同種不同株均具有良好的區(qū)分能力，由擴增圖譜建立的聚類樹狀圖能準確反映雙歧桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[30]。Hidenori等研究者用RAPD技術(shù)對母親和哺乳嬰兒體內(nèi)分離的各50株短雙歧桿菌進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)部分母體短雙岐桿菌轉(zhuǎn)移到嬰兒體內(nèi)，成為嬰兒腸道早期定植菌，具有更高的生長活力[31]。但早期的RAPD引物為非特異性，擴增受到PCR條件等多重因素影響，重復(fù)性和穩(wěn)定性相對較低。近年來，研究者篩選更多的RAPD引物，挑選出菌株特異的區(qū)分引物，提高了傳統(tǒng)RAPD方法的分型精度，達到菌株水平。如Toshimitsu等篩選了97對RAPD引物，挑選出能特異區(qū)分兩歧雙歧桿菌OLB6378的菌株特異性RAPD引物，可用于該特定菌株的檢測和計數(shù)[32]。

(2)擴增片段長度多態(tài)性分析。

擴增片段長度多態(tài)性分析 (Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)是一種建立在PCR技術(shù)和RFLP技術(shù)基礎(chǔ)上的檢測DNA多態(tài)性的分子分型技術(shù)。其主要步驟為：先對基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切；將含有粘性末端的接頭與酶切片段連接，作為擴增模板；以特異接頭序列作為引物PCR，獲得不同長度的擴增片段；凝膠電泳分離后對圖譜分析進行菌種鑒定。該技術(shù)既具有RAPD技術(shù)的高效性和方便性，又兼顧RFLP技術(shù)的可靠性和重復(fù)性，能對部分遺傳關(guān)系相近的雙歧桿菌進行區(qū)分。Dimitrov利用XhoⅠ和TaqⅠ兩個酶，建立了一種具有高度菌株特異性的AFLP分型方法，對20個分離自健康人體的雙歧桿菌鑒定，結(jié)果比PFGE的分辨力更高，操作也更簡便[33]。Hiroshi等利用AFLP和MLST方法，對8對母親和嬰兒的長雙歧桿菌進行追溯，發(fā)現(xiàn)其中11個長雙歧桿菌長雙歧亞種在母親和嬰兒的糞便中是同型的，這些菌株從出生后就定植在嬰兒的腸道內(nèi)，具有母體-嬰兒的家族特異性[24]。

(3)細菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)。

細菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù) (Repetitive DNA element PCR，Rep PCR)是1996年首先提出，主要原理是對細菌DNA中廣泛分布的短重復(fù)序列 (長度從30-40bp到150bp不等)擴增，電泳分析產(chǎn)物條帶，從而揭示基因組DNA之間的差異。主要有基因外重復(fù)回文系列(Repetitive Extragenic Palindromic，REP)、腸桿菌基因間重復(fù)一致序列 (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC)和BOX插入因子等幾類。Rep-PCR技術(shù)操作簡單，分辨效果好，可自動化，并可建立菌種REP-PCR、ERIC-PCR分型數(shù)據(jù)庫，近年來發(fā)展較快，也有學(xué)者將其應(yīng)用于雙歧桿菌分類鑒定中。

Ventura等利用ERIC-PCR對26個菌種的89個菌株進行分析，發(fā)現(xiàn)該方法能對大部分菌種有效區(qū)分，但對相近的種區(qū)分力較低，如鏈狀雙歧桿菌和假鏈狀雙歧桿菌[34]。Masco等用BOX-PCR技術(shù)對128個雙歧桿菌模式菌株、參考菌株和分離菌株鑒定，發(fā)現(xiàn)BOXA1R引物的區(qū)分力最佳，能在種和亞種水平，部分甚至在菌株水平鑒定，重現(xiàn)率高達92.5%～97%[35]。Waligora等利用Masco建立的BOX-PCR和多重PCR方法，對10個法國過敏癥嬰兒和20個對照者的胎糞中菌群分析，發(fā)現(xiàn)兩組嬰兒的菌種構(gòu)成無明顯差別，都有大量的雙歧桿菌分布，雙歧桿菌的多樣性和過敏狀態(tài)之間無明顯關(guān)聯(lián)[36]。

3 結(jié)束語

隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，雙歧桿菌作為益生菌的一大類，已用于多種食品的開發(fā)，包括嬰幼兒配方乳粉。因為益生菌作用具有菌株特異性，精確的菌株鑒定技術(shù)不僅是各國學(xué)者研究的重點，也將成為我國益生菌食品安全監(jiān)管的必然需求。傳統(tǒng)的生理生化技術(shù)已經(jīng)不能滿足精確的分型鑒定要求，但仍然作為標準方法用于培養(yǎng)和初步分型。各種分子生物學(xué)技術(shù)成為雙歧桿菌分型鑒定的主流方法。

未來的雙歧桿菌分類鑒定中，基因組序列的直接測定將成為重要的發(fā)展方向，特殊半保守基因序列分析將成為16S rDNA序列分型的有力補充。MLST技術(shù)因為涵蓋更多的基因信息和易于全球共享數(shù)據(jù)的模式，在雙歧桿菌鑒定和相關(guān)研究中的應(yīng)用將更廣泛。傳統(tǒng)的DNA印跡方法對于基因組中較大的差異有全局反映，但不能提供菌種以下的分辨力，應(yīng)用將受到局限?；诩毦禺愔貜?fù)序列的rep-PCR以及改良過的DNA印跡方法如特異菌株位點RAPD、AFLP技術(shù)具有亞種或菌株水平的分辨力，將成為PFGE方法的優(yōu)良候選。隨著雙歧桿菌基因組數(shù)據(jù)的不斷擴充，比較基因組分析將有助于開發(fā)精確的菌株鑒定技術(shù)，二代測序技術(shù)將在復(fù)雜生境下菌群快速分析中發(fā)揮更重要的作用。但無論哪一種方法，都應(yīng)當與其他方法互為補充，取長補短，多相分型依然是重要的分型鑒定思路。

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