呂 琦，鮑琳琳，許黎黎，鄧 巍，李楓棣，袁 靜，于 品，姚艷豐，秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

2013年3月底在上海和安徽兩地，爆發(fā)了H7N9亞型感染人的情況，為該亞型病毒全球首次出現(xiàn)。大多數(shù)病人出現(xiàn)呼吸道感染，重癥肺炎和呼吸困難的癥狀，病死率高達(dá)30%，至今尚無有效疫苗[1-3]。一旦該病毒獲得了人際間傳播的能力，必將引起流感大流行。H7N9疫苗的研制尚需時日，探討目前使用的季節(jié)性流感疫苗是否與H7N9病毒存在交叉變得很有必要。

為評價季流疫苗對H7N9流感病毒的保護(hù)性，我們于本所內(nèi)招募志愿者20位接種流感疫苗，體外評價疫苗對H7N9病毒的保護(hù)性。同時，為了得到H7N9流感病毒更廣泛免疫反應(yīng)，我們又將H7N9流感病毒感染雪貂制備抗血清與不同亞型病毒反應(yīng)，進(jìn)行了血清交叉免疫研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

流感病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9)，由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制研究所提供。其他流感病毒由WHO惠贈，A/California/07/2009(H1N1)、A/PR/8/34 (H1N1)、A/Brisbane/59/2007 (H1N1)、A/Brisbane/10/2007 (H3N2)、A/Shenzhen/406H/2006(H5N1)和A/Vietnam/1203/2004(H5N1)經(jīng)無特殊病原體(specific pathogen free, SPF) 雞胚增殖后收集病毒尿囊液。-80℃儲存?zhèn)溆茫瑢嶒灳贏BSL-3實驗室(注冊號：CNAS BL0010)中進(jìn)行。

1.1.2 動物

去勢雪貂1只，6月齡，900 g(本所繁殖)。實驗前進(jìn)行血清學(xué)檢查，血清反應(yīng)均為陰性方可實驗。

1.1.3 疫苗

季節(jié)性流感病毒裂解疫苗(2012～2013年)購自Glaxo SmithKline。該疫苗通過誘導(dǎo)針對表面抗原HA的中和抗體發(fā)揮保護(hù)作用。此疫苗包含兩種甲型流感病毒(H1N1和H3N2)和一種乙型流感病毒的三價亞單位疫苗。

1.1.4 志愿者信息

招募志愿者共20人，年齡25～45歲，男女性別比2∶1，同一地區(qū)生活。

1.2 方法

1.2.1 免疫

按說明書給于志愿者免疫，間隔14 d后加強(qiáng)免疫一次，末次免疫后14 d靜脈取血，血清RDE處理，用于測定對同型流感病毒A/California/07/2009(H1N1)及異型流感病毒A/Anhui/1(H7N9)的血凝抑制抗體效價和中和抗體效價。

1.2.1.1 血凝抑制試驗(HI)

使用0.5%的火雞血進(jìn)行小鼠血清HI實驗。按照OIE(World Organization for Animal Health)頒布的標(biāo)準(zhǔn)HI測定方法測定收集的血清對流感病毒血凝抑制效價。

1.2.1.2 微量中和試驗(NT)

血清倍比稀釋，4個復(fù)孔，加入等體積100 TCID50病毒混合，37℃孵育1 h后移入MDCK細(xì)胞中，37℃孵育72 h；火雞血測定凝血活性，以此判定細(xì)胞是否被感染。血球下流孔為中和抗體陽性，抗體效價按照Reed and Muench方法計算。

1.2.2 雪貂感染H7N9病毒及血清采集

實驗在ABSL-3實驗室中進(jìn)行。雪貂采用獸用氯胺酮0.1 mL/kg輕度麻醉，將A/Anhui/1(H7N9)病毒株以108TCID50滴鼻感染，雪貂鼻孔內(nèi)均勻滴入500 μL病毒液。獨立送風(fēng)隔離籠具中正常飼養(yǎng)。感染14 d后心臟取血，血清RDE處理,測定H7N9血凝抗體效價。

1.2.3 H7N9雪貂抗血清與H1/H3/H5亞型流感病毒交叉免疫反應(yīng)

測定雪貂H7N9轉(zhuǎn)陽抗血清與A/PR/8/34 (H1N1)、A/Brisbane/59/2007 (H1N1)、A/Brisbane/10/2007 (H3N2)、A/Shenzhen/406H/2006 (H5N1)和A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)等不同亞型病毒血凝抑制抗體效價和中和抗體效價。

2 結(jié)果

2.1 免疫后人群血清對同型H1N1與異型H7N9流感病毒的血凝抗體效價和中和抗體效價

末次免疫14d后受眾者靜脈取血，血清處理后，對同型流感病毒A/California/07/2009(H1N1)血凝抗體效價均在80以上，中和抗體效價均在256以上；對異型流感病毒A/Anhui/1(H7N9)血凝抗體反應(yīng)均為陰性，中和抗體反應(yīng)均為陰性。

2.2 雪貂抗血清HI抗體效價測定

A/Anhui/1 H7N9病毒株以108TCID50滴鼻感染雪貂，14 d后心臟取血，血清處理測定對H7N9流感病毒抗體抗體效價為640。

2.3 雪貂抗血清對H1/H3/H5亞型流感病毒血凝抑制抗體效價和中和抗體效價的測定

將雪貂H7N9抗血清與A/California/07/2009(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/Shenzhen/406H/2006(H5N1)、A/Vietnam/1203/2004(H5N1)和A/PR/8/34(H1N1)不同亞型流感病毒反應(yīng)，檢測HI抗體效價和中和抗體效價，結(jié)果顯示抗體反應(yīng)均為陰性。

3 討論

H7N9流感病毒是首次發(fā)現(xiàn)感染人的新亞型禽流感病毒，病死率高達(dá)30%，至今尚無有效疫苗，人群對此病毒也缺乏免疫力，一旦病毒通過進(jìn)化具有了人際傳播的可能性，必將引起流感大流行[1]。那么現(xiàn)有季節(jié)性流感疫苗能否防御此病毒就凸顯重要。于是本研究招募志愿者接種季流疫苗，分離轉(zhuǎn)陽血清，體外測定疫苗抗H7N9病毒作用，血凝抑制及中和試驗得出受眾者轉(zhuǎn)陽血清中無H7N9中和抗體，季節(jié)性流感疫苗接種人群不具有對新發(fā)H7N9流感病毒交叉保護(hù)。MichaT[4]研究也證實這一點，季節(jié)性流感疫苗不太可能誘導(dǎo)異型病毒間交叉抗體產(chǎn)生。為了反向驗證此結(jié)果并且得到H7亞型更廣泛免疫反應(yīng)，我們又將雪貂H7N9抗血清與不同亞型病毒作用，血凝抑制及中和試驗得出H7N9病毒與H1/H3/H5亞型流感病毒亦無交叉抗體反應(yīng)。當(dāng)然本實驗選用病毒種類數(shù)量以及受眾者數(shù)量和年齡梯度有限，并不完全說明問題，還需更多實驗數(shù)據(jù)加以驗證。

雖然季節(jié)性流感疫苗在流感防控中起到重要作用，但由于流感病毒HA抗原高度變異, 難以誘發(fā)甲型流感病毒不同亞型間交叉免疫保護(hù)。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，機(jī)體遭受流感病毒感染時中和抗體發(fā)揮主要作用，但在細(xì)胞免疫中T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)也至關(guān)重要[4]，Thomas PG等[5]證明，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞缺陷小鼠在攻毒后明顯恢復(fù)慢, 死亡率高；Deborah MB發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞缺陷小鼠對A型流感病毒攻擊時T細(xì)胞反應(yīng)也可獨立起一定的作用。與抗體應(yīng)答不同，流感病毒的NP蛋白序列高度保守，其抗原肽能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生同型和異型病毒株的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞交叉免疫反應(yīng)。Chang H等[6,7]研究，在小鼠免疫季節(jié)性流感疫苗后，加強(qiáng)免疫同亞型NP蛋白，將完全保護(hù)小鼠抵御異型流感病毒攻擊，這提示再無有效疫苗時，用此免疫方式抵御H7N9流感病毒，能否得到同樣的效果，如果可以這將對H7N9流感病毒的防治策略給予重要提示意義。

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