李彥紅，黃 瀾，朱 華，徐艷峰，隋小龍，徐玉環(huán)，韓云林，馮曉純，秦 川

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021； 2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春 130021)

過敏性紫癜(henoch-schonlei purpura，HSP)是一種由IgA免疫復(fù)合物沉積介導(dǎo)的小血管炎癥性疾病。它是最常見的兒童血管炎性疾病，據(jù)報道每年的發(fā)病率為6.1～26.5/100 000[1-2]。它的病因?qū)W不完全清楚，但是暴露于很多抗原如感染性物質(zhì)、疫苗及藥物很可能會激發(fā)免疫學(xué)改變[3-4]。診斷主要是依據(jù)非血小板減少性紫癜的出現(xiàn)，且紫癜的部位主要位于四肢末端和臀部。其中胃腸道損傷大約占據(jù)患者1/2～2/3，其它的臨床癥狀包括關(guān)節(jié)痛或關(guān)節(jié)炎、軟組織腫脹、血尿或蛋白尿等[5]。結(jié)合過敏性紫癜患者病理改變和實驗室發(fā)現(xiàn)的急性期小血管壁IgA沉積，多核中性粒細(xì)胞在血管周圍浸潤，血清IgA和促炎細(xì)胞因子水平增多，因此該病被認(rèn)為是一種特定的免疫介導(dǎo)的疾病[5]。該病復(fù)發(fā)率高，病程遷延，并發(fā)癥多，臨床多采用支持治療，對最嚴(yán)重的過敏性紫癜性腎炎(henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN)目前仍無滿意治療效果[6]。本文通過對構(gòu)建的過敏性紫癜大鼠和兔模型及患者血液免疫學(xué)指標(biāo)的檢測，比較指標(biāo)的改變情況及異同，從而更好的依靠模型為人類疾病機制探討、診斷及治療提供幫助。

1 方法和材料

1.1 實驗動物和臨床標(biāo)本

1.1.1 SD大鼠和新西蘭大耳白兔

4周齡SD大鼠，體重75～95 g，22只，模型組和對照組，每組雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(SCXK(京)2012-0001)；1.5月齡日本大耳白兔28只，體重1.2～1.4 kg，18只雌雄各半為模型組，10只雌雄各半為對照組，北京芳元緣養(yǎng)殖場提供(SCXK(京)2009-0014)。動物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所SPF級動物房(SYXK(京)2011-0022)，實驗操作已經(jīng)過實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準(zhǔn)(許可證號：ILAS-PL-2012-005)。

1.1.2 人的標(biāo)本

患者系長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科住院兒童，4～12歲，多為住院2～5 d時采集的血液標(biāo)本?；颊呷把?2份，對照全血及血清10份，這些患者主要表現(xiàn)為皮膚明顯的對稱性紫癜，主要在雙下肢，有的可見蛋白尿、血尿。對照血清多采自本院即將康復(fù)出院且無并發(fā)癥表現(xiàn)的兒童。

1.2 模型的構(gòu)建

干姜、蓽茇、胡椒水煎劑購自中醫(yī)藥大學(xué)北京東直門醫(yī)院，1∶1∶1的比例混合配成終濃度15 g/100 mL的水溶液，模型組兔口服給藥，每次1 mL，模型大鼠灌胃給藥，每次0.5 mL，1次/日， 對照組分別給以等量生理鹽水，其他條件相同。用藥3 周，模型組兔腹腔注射含卵白蛋白(F5503, Sigma)10 mg的生理鹽水0.5 mL與弗氏完全佐劑(F5881，Sigma)以1:1比例混合的乳化溶液1 mL，大鼠注射0.5 mL，1次/周，連續(xù)3 周。對照組分別腹腔注射等量的生理鹽水。之后，模型組兔耳緣靜脈注射10 mg/mL的卵白蛋白生理鹽水0.5 mL，模型大鼠尾靜脈注射0.25 mL，同時大鼠和兔的背部皮膚剪毛，皮內(nèi)注射0.3%卵白蛋白生理鹽水1 mL，分5點注射，每點0.2 mL。對照組分別以同樣劑量和方法給以等量生理鹽水。之后觀察皮膚紅腫狀況，照相存檔。

1.3 過敏性紫癜大鼠和兔模型的癥狀特點

抗原激發(fā)后，24 h內(nèi)觀察模型組大鼠和兔的背部皮膚水腫，瘀斑的大小、分布、癥狀出現(xiàn)的比例及隨時間改變情況。

1.4 血液學(xué)指標(biāo)檢測

抗原激發(fā)后24 h內(nèi)，取大鼠和兔血，測大鼠、兔和人血常規(guī)(Rayto RT-7600S,USA)；1 000 r/min離心，取上清，放射免疫法檢測大鼠細(xì)胞因子IL-2,TNF-α (XH-6020γ-免疫計數(shù)器，China)；ELISA測細(xì)胞因子IL-4(KB2731,酶標(biāo)儀ST-360,China)，流式細(xì)胞術(shù)方法檢測白細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD4(11-0040-82,eBioscience,USA),CD8(11-0084-82,eBioscience,USA)；用流式細(xì)胞儀 (BECTON DICKINSON FACSCalibur, USA)；免疫比濁法(HITACHI.7080, Japan)檢測血清IgA,IgE,IgG,C3,C4的含量。

ELISA方法檢測兔細(xì)胞因子IL-2 (CSB-E08745Rb,Cusabio,USA),TNF-α (CSB-E06998Rb,Cusabio,China)及白細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD3 (RTC0247,NeoBiolab,USA),CD4 (CSB-E12791Rb,Cusabio, China)，CD8 (CSB-E12790Rb,Cusabio,China)等，免疫比濁法檢測兔血清IgA,IgE,IgG,C3,C4的含量。

ELISA方法檢測患者血清免疫細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD3(BH5632,China),CD4 (BH1061,China),CD8(KA0133,China)，細(xì)胞因子IL-2(HE0064,China)，TNF-α (BH1105,China), IL-4(HE0060,China)；免疫比濁法檢測免疫球蛋白IgA,IgE,IgG及補體C3,C4的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 實驗結(jié)果

2.1 癥狀表現(xiàn)

大鼠和兔子在抗原激發(fā)后，24 h內(nèi)均出現(xiàn)不同程度的出血斑點，大鼠的出血斑點在6～8 h出現(xiàn)，16～18 h后逐漸增多，彌散分布，直徑1 mm大小，周圍無紅腫滲出，出血斑點出現(xiàn)的比例大約為40%(4/10)；兔子的出血斑點在6～8 h出現(xiàn)，并逐漸增大，周圍有紅腫，14～18 h呈多個片狀紫斑，形狀不規(guī)則，直徑多在1 cm左右，少數(shù)有滲出，出血斑塊出現(xiàn)的比例約為85%(24/28)(封3圖1)。兩種模型動物出血斑在24 h后逐漸結(jié)痂壞死，2周后逐漸緩解，3周明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 模型病理改變

模型大鼠和兔組織切片HE染色，光鏡下發(fā)現(xiàn)模型組大鼠和兔均出現(xiàn)不同程度的皮下出血，真皮水腫，血管擴張充血、出血，炎細(xì)胞浸潤；腎小球囊腔蛋白滲出物，血管擴張充血出血等；還可見到關(guān)節(jié)腔淤血，結(jié)締組織壞死，炎細(xì)胞浸潤等；胃黏膜可見出血，上皮細(xì)胞壞死脫落；小腸絨毛血管擴張充血，上皮細(xì)胞脫落；肺肝淤血，灶性炎細(xì)胞浸潤；還有少量大鼠和兔腦膜血管擴張充血，炎細(xì)胞浸潤等等。(封3圖2)

2.3 血液學(xué)指標(biāo)

2.3.1 Hsp大鼠模型、兔模型及患者血常規(guī)檢測結(jié)果

模型組大鼠急性期血常規(guī)白細(xì)胞(WBC)升高，淋巴細(xì)胞(LYM)減少，中性粒細(xì)胞(Gran)升高(P<0.05)，淋巴細(xì)胞百分比(LYMPH%)減少，粒細(xì)胞百分比(Gran%)升高(P<0.01)，血小板(PLT)無明顯改變(圖3A)；模型兔WBC, Gran, 嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)升高(P<0.05)，LYMPH%減少(P<0.01)，Gran%和嗜酸性粒細(xì)胞百分比(EOS%)升高(P<0.05)，PLT無明顯改變(圖3B)；患者(n=10)35%WBC升高，10%LYMPH下降，20%Gran升高，20%LYM%下降，30%Gran%升高，PLT無明顯改變。

2.3.2 Hsp大鼠模型、兔模型及患者血清免疫球蛋白及補體檢測結(jié)果

模型組大鼠血清免疫球蛋白IgA升高(P<0.05)，IgG升高(P<0.01)，補體C3，C4減少(P<0.05)，IgE無明顯改變(圖3C)；模型組兔血清IgA升高，IgG降低(P<0.05)，C3，C4減少(P<0.01)，IgE無明顯改變(圖3D)；患者(n=10)血清IgA， IgE升高(P<0.01)，IgG升高(P<0.05)，C3，C4減少(P<0.05)(圖3E)

2.3.3 Hsp大鼠模型、兔模型及患者血免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子檢測結(jié)果

模型組大鼠、兔及患者血均有CD4百分比下降，CD4/CD8比值下降，IL-4、TNF-α水平升高，差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義；模型大鼠和兔CD8%升高(P<0.05)，患者體內(nèi)CD8%無明顯差異；模型組兔和患者體內(nèi)IL-2水平下降(P<0.05)，模型大鼠體內(nèi)IL-2水平無差異。(表1,2,3)

3 討論

過敏性紫癜大鼠和兔模型在表型上基本都出現(xiàn)了出血斑點的癥狀，但大小和程度不同，大鼠的皮膚斑點呈現(xiàn)彌漫形分布，直徑2 mm左右，周圍未見紅腫。兔的皮膚出血斑點大，直徑大多在1 cm左右，還有融合斑點，周圍紅腫。兩種模型在皮膚癥狀出現(xiàn)的時間上大致相同，在激發(fā)后6～8 h后開始出現(xiàn)反應(yīng)，14～18 h后基本出現(xiàn)明顯癥狀。大鼠出現(xiàn)癥狀的比例不如兔子的高。所有的過敏性紫癜患者形成非瘙癢性皮疹，開始是短暫的紅斑丘疹或蕁麻疹樣水皰，之后成熟呈片狀出血斑和紫癜[7]，直徑最大超過10 mm，并可形成明顯的瘀斑，顏色從紅色到紫色，最后到鐵銹色直至褪去大概需要幾天或幾周[8]。大鼠和兔子模型在病理上有相似的改變，均出現(xiàn)關(guān)節(jié)結(jié)締組織炎癥、胃腸道粘膜損傷，出血、腎小球囊腔滲出物，血管擴張淤血等病變。75%的患者有關(guān)節(jié)炎癥狀，包括熱、腫脹、質(zhì)地軟，該癥狀是短暫的，不會產(chǎn)生畸形，15%～25%的患者可在紫癜出現(xiàn)前先出現(xiàn)關(guān)節(jié)癥狀[9-10]。60%～65%的患者可形成急性腹痛，約30%的患者出現(xiàn)嘔吐和胃腸道出血[11]。腎臟疾病是最嚴(yán)重的后遺癥，雖然該病的死亡者很少，但腎臟疾病是導(dǎo)致死亡的主要原因[12]。綜上，兩種模型癥狀及病理改變與人類疾病相似，可為人類疾病研究提供幫助。

注：A 大鼠血常規(guī)結(jié)果B兔血常規(guī)結(jié)果C大鼠血免疫球蛋白和補體結(jié)果 D兔血免疫球蛋白和補體結(jié)果 E患兒血免疫球蛋白和補體結(jié)果(注：*P<0.05,#P<0.01，同對照組相比)。

表1 大鼠免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子檢測

表2 兔血清免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子檢測

表3 患者免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子檢測

大鼠和兔模型急性期血常規(guī)都有WBC,NEU數(shù)目不同程度的增多，LYM減少，患者血常規(guī)檢測，雖也有WBC，NEU細(xì)胞數(shù)目增多，LYM細(xì)胞數(shù)目減少，但這種改變是散在的，不確定性的，大鼠、兔模型和患者血中都不存在LTP數(shù)目的明顯改變。模型大鼠、兔和患兒血清急性期存在不同程度的CD3含量下降，CD4%減少，CD8%增加，CD4/CD8比值下降，血清細(xì)胞因子IL-4，TNF-α水平增加，但在大鼠血清IL-2水平改變沒有差異，兔子血清IL-2水平下降，患兒血清IL-2水平增加。Wiercinaski[13]等在對HSP 急性期患兒外周血 T 淋巴細(xì)胞亞群檢測中發(fā)現(xiàn)CD4+T數(shù)量降低， CD8+T數(shù)量增高，CD4/CD8比值降低。該研究與我們的研究結(jié)果一致。有報道，HSP患者血清IL-4水平升高，IL-2水平降低[14]，該結(jié)果與兔模型的研究結(jié)果一致。研究表明過敏性紫癜腎炎患者IL-2水平降低，HSP急性期IL-2受體數(shù)目和功能較正常者升高和增強，與疾病的活動性相關(guān)[15]。該結(jié)果與本文患者研究結(jié)果相似，說明IL-2水平的改變沒有統(tǒng)一的結(jié)果。Besbas等[16]報道HSP患者急性期血清促炎細(xì)胞因子TNF-α的水平明顯增加，該報道與本文大鼠、兔及人的研究結(jié)果一致。因此HSP發(fā)病機制與T細(xì)胞功能改變密切相關(guān)。大鼠、兔、患者血清急性期IgA水平均增加，C3,C4水平均下降，但大鼠急性期IgE水平?jīng)]有明顯改變，IgG水平增加，兔急性期IgE沒有明顯改變，IgG水平減少，患者急性期血IgE, IgG水平均增加。HSP被認(rèn)為是一種IgA免疫復(fù)合物介導(dǎo)的疾病[17]，IgA復(fù)合物沉積在皮膚、小腸及腎小球等部位激發(fā)局部的炎癥應(yīng)答。目前報道超過一半的HSP病人血清IgA水平增加[9,18-19]。該報道與本文大鼠和兔模型及患者的檢測結(jié)果一致。Levy等[20]報道18.7%的HSP患者血清C4水平下降，Smith等[21]也報道8%的HSP患者血清C4水平下降，Islek等[22]報道的HSP患者中8%血清C3下降。這些結(jié)果與本文的檢測結(jié)果血清C3,C4均有不同程度的下降相似。HSP患者，C3,C4在組織損傷部位活性增強，但它們的血清水平與疾病的嚴(yán)重性不相關(guān)[23]。患者血清IgG, IgE水平文獻(xiàn)報道不完全一致，有報道IgG減少，增加或無明顯改變，IgE水平增加或無明顯改變[24-26]。普遍認(rèn)為血清免疫球蛋白的失衡，主要增加腎臟受累的機會。Kondo[27]對HSP 患者 IgA 升高機制的研究發(fā)現(xiàn)活動性HSP，IgA分泌細(xì)胞的均值達(dá)正常的2倍, 其敏感性為95.7%， 特異性為90.9%[27]?？梢姡琁gA是參與HSP發(fā)病機制的主要免疫球蛋白，其診斷對疾病的診斷具有重要意義。

綜上，過敏性紫癜兩種動物模型，發(fā)病癥狀、病理及免疫相關(guān)指標(biāo)改變與人類疾病發(fā)病均相似，但相對而言，兔模型操作方便，發(fā)病穩(wěn)定，體型大容易觀察。兩種模型可為該病機制研究和藥物篩選評價提供更多的研究途徑，也可根據(jù)需要選擇相應(yīng)模型。

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