張芳 綜述 李洋 周清華 審校

微小RNA（microRNA, miRNA）是一種內(nèi)源性的非編碼的RNA序列，一般由21-23 nt組成單鏈RNA分子，廣泛存在于各種生物體中[1]，通過對靶miRNA的直接分解或抑制其翻譯的方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達[2]，RNAase III超家族成員Drosha剪切pri-miRNA形成pre-miRNA，后者進而被Dicer剪切形成成熟的miRNA[3]。

1 微小RNA在腫瘤中的生物學功能

1993年Lee等[4]在酵母中發(fā)現(xiàn)lin-4和let-7失活使上皮細胞傾向于分裂而不是正常分化，提示miRNA具有重要的生理功能。2002年Calin等[5]首次在慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia, CLL）中發(fā)現(xiàn)has-miR-15a和has-miR-16-1下降或缺失，確立了miRNA與腫瘤的相關性。miRNAs參與生理、病理過程，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中，不同的miRNAs分別發(fā)揮抑制腫瘤（tumor suppressor miRNA, TSmiRs）或促進腫瘤作用（oncogenic miRNAs,oncomiRs）[6]。過去的研究[7]表明miRNA基因表達的改變幾乎與人類大多數(shù)惡性腫瘤病理形成有關，引起基因表達改變機制包括：缺失、擴增、miRNA位點突變、表觀遺傳基因沉默、以特定miRNAs為靶點的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的紊亂等。Volinia等[8]通過進行大規(guī)模的腫瘤miRnome分析，確定了一些腫瘤相關的miRNA，例如miR-17-5p、miR-20a、miR-21、miR-92、miR-106a以及miR-155等，它們通過調(diào)節(jié)一些重要的癌基因或抑癌基因表達影響腫瘤發(fā)生。人們相繼發(fā)現(xiàn)microRNA參與人體多種生命活動，可以促進細胞增殖[9]、對細胞的凋亡通路進行調(diào)節(jié)[10]、參與細胞周期的調(diào)控[11]、參與人體的代謝過程[12,13]等。MiRNA不僅參與細胞增殖、分化、凋亡、周期調(diào)控等，對腫瘤的化療耐藥也具有重要作用。有研究表明miRNA與腫瘤轉(zhuǎn)移有關。Nicoloso等[14]發(fā)現(xiàn)同種的miRNA不僅使特定腫瘤細胞具有侵襲能力，而且使腫瘤干細胞表現(xiàn)出特定表型，提示了在腫瘤起源和最后形成的機制之間的聯(lián)系。

Calin等[15]研究證實了miRNA，特別是腫瘤相關miRNA在染色體上的特殊性，即腫瘤相關miRNA經(jīng)常定位于一些染色體高變區(qū)域，可能導致LOH，缺失以及擴增等，從而引起miRNA表達變化或突變、缺失等，影響下游腫瘤相關基因表達，導致腫瘤發(fā)生。他還闡述了miRNA表達譜在腫瘤診斷、預后以及治療效果監(jiān)控方面的應用[16]。Yu等[17]篩選出胰腺癌細胞中高表達的miRNA，并研究發(fā)現(xiàn)miR17-5p與患者預后差有關，并能促進腫瘤細胞增殖和侵襲。Iorio等[18]通過基因芯片和Northern blot分析發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中總miRNA表達與正常組織明顯不同，差異表達的miRNA與某些乳腺癌生物病理特征有關，如雌激素和孕酮受體的表達、腫瘤分期、血管侵襲、增殖指數(shù)。

Mavrakis等[19]應用無偏倚的miRNA文庫篩選（unbiased miRNA library screen）的方法，系統(tǒng)研究了急性T淋巴細胞白血?。═-ALL）相關的miRNAs，發(fā)現(xiàn)5個miRNAs（miR-19b、miR-20a、miR-26a、miR-92以及miR-223）在T-ALL發(fā)病中起到關鍵作用，并且這些miRNAs在T-ALL發(fā)生過程中抑制主要抑癌基因（例如IKZF1、PTEN、BIM、PHF6、NF1、FBXW7等）表達的作用相互重疊，相互協(xié)調(diào)。該研究揭示了T-ALL發(fā)生中microRNA-腫瘤抑制基因作用的新模式。

細胞耐藥性是腫瘤化學治療中的難題，關于miRNAs與腫瘤細胞耐藥性的研究很多，也取得了一定的進展。Xia等[20]用miRNA芯片篩選出了人胃癌多藥耐藥細胞株中miRNAs的異常表達。miR-15b和miR-16在人胃癌多藥耐藥細胞株中表達下調(diào)，可以引起B(yǎng)cl-2蛋白表達的增加，提示miR-15b和miR-16通過靶向作用于Bcl-2而導致胃癌細胞多藥耐藥性的形成，進而影響細胞凋亡。秦學博等[21]以吉非替尼敏感肺癌細胞PC9與吉非替尼耐藥肺癌細胞PC9/AB11為細胞模型，初步篩選到了13個與肺腺癌吉非替尼耐藥密切相關的miRNA。miRNA促進或逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的化學藥物耐藥性。

2 順鉑耐藥機制研究

順鉑臨床應用于實體瘤中，有較廣的抗癌譜，是已知的最有效的抗瘤藥物之一。順鉑耐藥限制了以順鉑為基礎的化療，順鉑耐藥性的產(chǎn)生機制可能包括：藥物吸收減少、藥物滅活增加、DNA加合物修復增強。這些產(chǎn)生耐藥的藥理學機制起源于分子水平的改變，包括DNA損傷的識別、HER-2/neu基因的過表達、PI3-K/Akt通路的激活、p53功能的缺失、抗凋亡基因bcl-2的過表達、對細胞凋亡途徑caspase途徑的干擾等。通過研究，順鉑耐藥的機制不斷被人們發(fā)現(xiàn)。一系列的DNA修復序列表明鉑類-DNA加合物的移除與人類A2780/C系列卵巢癌順鉑耐藥有關。Ferry等[22]研究表明核酸切除修復的增強可導致細胞株的耐藥，順鉑耐藥被證實與對紫外線抵抗的增強有關，同時ERCC1的過表達也與順鉑耐藥有關，進一步表明在順鉑耐藥模型中，ERCC1-XPF核酸內(nèi)切酶是核酸切除修復的決定性因素。內(nèi)切修復交叉補體1（excision repair crosscomplementing 1, ERCC1）基因表達水平與順鉑DNA加合物的修復有重要關聯(lián)，有研究報道也與腫瘤細胞順鉑耐藥水平有關。Chang等通過將ERCC1siRNA1和siRNA2轉(zhuǎn)染細胞，發(fā)現(xiàn)ERCC1 mRNA和蛋白質(zhì)表達均被明顯抑制。在HeLa S3細胞中ERCC1表達的抑制導致順鉑誘導的DNA損傷修復活性的減低。從而為ERCC1siRNA應用于治療腫瘤提供了新的發(fā)現(xiàn)[23]。MDR多藥耐藥性仍然是腫瘤化學治療失敗的主要原因之一，MDR1/P-gp過表達被認為是腫瘤細胞多藥耐藥的機制。Twist1與頸椎癌放療耐受及化療耐藥有關，Zhu等[24]研究證實Twist1介導的MDR1/P-gp表達在頸椎癌細胞順鉑敏感性起重要作用，Twist1基因的沉默能下調(diào)MDR1/P-gp的表達。因此通過抑制Twist1表達來克服頸椎癌藥物耐受可能成為頸椎癌治療的新方法。卵巢癌患者用順鉑治療一段時間后很容易產(chǎn)生對其的耐藥性，Olivero等[25]研究表明肝細胞生長因子HGF可以增強順鉑治療后卵巢癌細胞的死亡率。Holford等[26]通過卵巢癌細胞株體外實驗發(fā)現(xiàn)具有空間位阻效應的鉑類復合物AMD473可以使細胞逃避順鉑耐藥。

3 MiRNA在腫瘤順鉑耐藥的作用

肺癌是人類最常見腫瘤及死亡原因之一，目前公認的晚期非小細胞肺癌一線治療標準是含鉑的兩藥聯(lián)合方案。以鉑類為基礎聯(lián)合應用重組人血管內(nèi)皮抑素或靶向化療藥物等方案被證實具有較好的療效[27]。然而在使用順鉑化療過程中，易產(chǎn)生順鉑耐藥性，從而為肺癌患者化療提出了難題。人們也在不斷研究順鉑耐藥機制并尋找克服或逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的方法。如Meng等[28]發(fā)現(xiàn)新城疫病毒NDV通過caspase途徑可以誘導耐藥肺腺癌細胞A549/DDP的凋亡，特別是caspase-9途徑。同時MAPK通路及Akt途徑也參與凋亡誘導過程。通過小鼠A549/DDP肺癌模型證實NDV有溶瘤作用。該研究從體外和體內(nèi)試驗研究表明NDV可以克服肺癌細胞的順鉑耐藥。其中關于miRNA與肺癌順鉑耐藥性的研究也很多。Galluzzi等[29]利用芯片技術來篩選人非小細胞肺癌順鉑耐藥株A549/DDP中表達上調(diào)的miRNA。人工合成的靶向作用于miR-181a和miR-630的miRNA抑制劑作用于A549/DDP細胞后，pre-miR-181a和pre-miR-630表達增加，CDDP引發(fā)的細胞死亡減少。premiR-181a和pre-miR-630調(diào)節(jié)體內(nèi)凋亡的線粒體/線粒體后途徑，包括Bax寡聚核苷酸化、線粒體膜溶解、成熟的caspase-9和caspase-3的蛋白水解。另外，pre-miR-630阻斷上游由于DNA損傷而引發(fā)繼而引起p53激活的信號傳導通路。該研究表明miR-181a和miR-630可以作為非小細胞肺癌對順鉑化療的新型調(diào)節(jié)劑。

4 肺癌中miRNA的研究進展

MiRNA促進肺癌轉(zhuǎn)移。O'Donnell等[30]發(fā)現(xiàn)，miR-17-92與小細胞肺癌中高表達的癌基因c-Myc相關，c-Myc基因過表達引起了miR-17-92的高表達。miR-17-92能加快癌細胞的生長，但其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚不清楚，根據(jù)對其靶點預測其機制可能是通過抑制兩個抑癌基因PTEN（phosphatase and tensin homolog）和Rb2而發(fā)揮其促進腫瘤作用。miR-21的靶點已被證明是多個腫瘤抑制基因的mRNA，包括PTEN、PDCD（programmed cell death）、TPM1（tropomyosin 1）和SerpinB5（serpin peptidase inhibitor, clade B member 5）基因，這些基因不僅對癌細胞惡性轉(zhuǎn)化起負調(diào)控作用，而且能夠抑制細胞運動和侵襲[31-34]。

MiRNA抑制肺癌的轉(zhuǎn)移。let-7 miRNA家族是典型的具有抑癌作用的分子，其表達水平在多種腫瘤中明顯下調(diào)，Ras和Myc的mRNA 3'UTR區(qū)有多個let-7結(jié)合位點，let-7靶向結(jié)合在其上導致翻譯抑制，從而負向調(diào)控二者的表達；相反，let-7的減少必然導致相應蛋白的過表達，引起細胞轉(zhuǎn)化，進而導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[35]。miR-125b-1定位于11q23-24雜合型缺失（loss of heterozygosity, LOH）的微小區(qū)域，這一區(qū)域在肺部腫瘤、乳腺癌和卵巢癌中存在突變或缺失，提示miR-125b-1發(fā)揮了抑癌基因的作用。有研究表明，肺癌組織中miR-125b-1基因突變與肺癌患者的臨床病理特征相關，且該基因突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在正相關，表明miR-125b-1功能異常能增加患者發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的風險性，從而可能在肺癌細胞的轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[18]。

MiRNA調(diào)節(jié)肺癌細胞表型轉(zhuǎn)化。Korpal等[36]報道，下調(diào)miR-200c表達可促進EMT發(fā)生，提高腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力；而過表達miR-200c可抑制EMT發(fā)生，降低腫瘤細胞侵襲力。上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換（epithelialmesenchymal transition, EMT）是指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學過程。通過EMT，上皮細胞失去細胞極性以及與基底膜連接等上皮表型，獲得了具有較高遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質(zhì)等能力的間質(zhì)表型。EMT是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程。

針對腫瘤患者循環(huán)系統(tǒng)中miRNA的研究已經(jīng)開始，為研究肺癌轉(zhuǎn)移過程中miRNA的作用開辟了一條新的道路。Rabinowits等[37]發(fā)現(xiàn)肺癌病人血液循環(huán)中的總腫瘤外切體和miRNAs水平與正常人有明顯的不同，然而肺癌患者與健康人之間血液循環(huán)中的miRNA外切體及具有促腫瘤形成的miRNA種類相類似。提示可以將血液循環(huán)中的miRNA外切體作為肺腺癌的篩選試驗。

5 MiRNA的前景展望

MiRNA可調(diào)控約三分之一的蛋白編碼基因的表達，影響著多條信號傳導通路。miRNA在不同腫瘤組織中表達水平的研究和分析，不僅有利于闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制，更為腫瘤的診斷和治療提供了理論依據(jù)。隨著對miRNA與腫瘤耐藥性的研究進展及發(fā)現(xiàn)，以miRNA為靶點設計新的藥物將為阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移、改善患者預后提供有效的治療途徑。