宿俊杰， 靳 玫， 劉曉利， 唐超智， 賈盼盼綜述， 王文晟審校

核苷酸重復(fù)序列普遍存在于真核生物基因組。在染色體上經(jīng)常出現(xiàn)一些重復(fù)序列，如(CCG)n、(CCTG)n等。相比一般DNA序列，這些重復(fù)序列更不穩(wěn)定。其拷貝數(shù)易增加或減少，導(dǎo)致重復(fù)序列擴(kuò)展或縮減［1，2］。重復(fù)序列在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)等過(guò)程中易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)導(dǎo)致重復(fù)序列的變異，進(jìn)而導(dǎo)致人類神經(jīng)退行性疾病。神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative disease，NDDs)是一種以大腦和脊髓細(xì)胞神經(jīng)元喪失的為特征的疾病。隨著人口老齡化的發(fā)展，NDDs將超過(guò)癌癥，成為繼心血管疾病之后的第二大死亡原因。在神經(jīng)退行性疾病中，有約40種是由重復(fù)序列的突變引起的。本文對(duì)重復(fù)序列不穩(wěn)定的特征、機(jī)制及其與NNDs的相關(guān)性進(jìn)行綜述。

1 與重復(fù)序列突變相關(guān)的神經(jīng)性退行疾病

重復(fù)序列突變是一種獨(dú)特的變異，它和近40種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。不像其他變異，重復(fù)序列的變異是動(dòng)態(tài)的。引起各種NNDs的重復(fù)序列的類型、相關(guān)基因及位置等。

2 重復(fù)序列突變的機(jī)制

正確理解引發(fā)疾病的重復(fù)序列變異的機(jī)制對(duì)開(kāi)辟新的治療途徑和研發(fā)新藥物至關(guān)重要。由于重復(fù)序列的特殊性，易形成非正常DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。正常情況下，這些非正常的二級(jí)結(jié)構(gòu)在DNA代謝過(guò)程中被清除掉，然而當(dāng)清除過(guò)程異常時(shí)，就引起重復(fù)序列突變［1，2］。

2.1 重復(fù)序列的結(jié)構(gòu) 重復(fù)序列易形成的非正常二級(jí)結(jié)構(gòu)的特性與其對(duì)稱性，序列組成，超螺旋等方面的因素是密切相關(guān)的。雖然這些二級(jí)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)無(wú)法探知，但在體外的實(shí)驗(yàn)中許多已被證實(shí)。如(CCTG)n·(CAGG)n折疊形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，(CCG)n·(CGG)n和(CGCG4CG4)n能折疊成G四鏈結(jié)構(gòu)，(CTG)n·(CAG)n能形成“十字”結(jié)構(gòu)，(GAA)n·(TTC)n在負(fù)超螺旋影響下能形成H-DNA。這些異常的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重影響DNA復(fù)制、修復(fù)、同源重組及轉(zhuǎn)錄等過(guò)程［3］。下面就重復(fù)序列形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致重復(fù)序列的不穩(wěn)定機(jī)制進(jìn)行解釋。

2.2 重復(fù)序列突變形成的分子機(jī)制 對(duì)于重復(fù)序列是如何在DNA代謝過(guò)程中產(chǎn)生擴(kuò)增或縮減的，有以下幾種機(jī)制。

2.2.1 DNA復(fù)制機(jī)制 在對(duì)酵母等的研究中發(fā)現(xiàn)許多參與DNA復(fù)制，特別是與岡崎片斷成熟過(guò)程中有關(guān)的蛋白質(zhì)發(fā)生變異時(shí)引發(fā)急劇升高的重復(fù)序列的不穩(wěn)定。DNA復(fù)制模型又包括兩種假說(shuō)。第一種是Harvey于1997年提出的“鏈滑動(dòng)”假說(shuō)［4］。該假說(shuō)認(rèn)為，DNA復(fù)制過(guò)程中，含有不穩(wěn)定重復(fù)序列的DNA單鏈作為模板合成新鏈時(shí)，會(huì)由于鏈的滑動(dòng)作用造成堿基錯(cuò)配，若錯(cuò)配引起新生鏈上形成泡狀或者發(fā)夾等結(jié)構(gòu)，該新生鏈作為模板鏈在下一輪復(fù)制時(shí)就會(huì)造成重復(fù)序列的擴(kuò)增或縮減。近年，Mirkin提出在滯后鏈合成過(guò)程中復(fù)制叉的暫停與重新啟動(dòng)假說(shuō)，即在滯后鏈模板中，由重復(fù)序列形成的異常二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)拖延滯后鏈的合成，破壞其與前導(dǎo)鏈合成的協(xié)調(diào)性［3］。該模型可以在分子水平上解釋一些重復(fù)序列擴(kuò)展的遺傳特征。

2.2.2 DNA修復(fù)機(jī)制 許多DNA修復(fù)包含了部分DNA復(fù)制的過(guò)程，像FEN1、PCNA等DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)同樣也參與了DNA修復(fù)，因而在修復(fù)過(guò)程中，重復(fù)序列的DNA同樣會(huì)形成滑動(dòng)鏈的結(jié)構(gòu)。另外，非有絲分裂的組織(如腦組織)或DNA修復(fù)缺陷的組織同樣出現(xiàn)大量的重復(fù)序列突變現(xiàn)象。因此DNA修復(fù)同樣也與穩(wěn)定重復(fù)序列突變發(fā)生的過(guò)程有關(guān)。根據(jù)DNA修復(fù)的類型，造成重復(fù)序列的不穩(wěn)定的原因可以從以下4個(gè)方面進(jìn)行闡述。(1)錯(cuò)配修復(fù):在轉(zhuǎn)基因老鼠中，CAG/CTG的擴(kuò)展離不開(kāi)錯(cuò)配修復(fù)蛋白質(zhì)MSH2、MSH3和PMS2的功能。MSH2的變異導(dǎo)致重復(fù)序列的擴(kuò)展停止。而MSH3的失活使CTG/CAG重復(fù)序列發(fā)生縮減，這為 CTG/CAG 疾病的治療提供了新思路［5～7］。(2)堿基切除修復(fù)(BER):研究發(fā)現(xiàn)HD和FXS小鼠氧化促進(jìn)三核酸重復(fù)序列的擴(kuò)展，雙氧水處理可誘導(dǎo)人的HD細(xì)胞的重復(fù)序列擴(kuò)展，這些結(jié)果暗示重復(fù)序列的擴(kuò)展是在堿基切除修復(fù)(BER)這一過(guò)程中產(chǎn)生的，另外，失去氧化堿基切除修復(fù)酶-8-鳥(niǎo)嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)功能的小鼠抑制重復(fù)序列擴(kuò)展的發(fā)生的事實(shí)也支持了這一觀點(diǎn)［8，9］。在去除氧化堿基后，BER是通過(guò)部分DNA合成完成的。這一過(guò)程和岡崎片斷的成熟類似，產(chǎn)生的含重復(fù)序列的單鏈Flap會(huì)形成發(fā)卡和環(huán)狀中間物阻止FEN1切除重復(fù)的Flap，導(dǎo)致 DNA的擴(kuò)展［10］。(3)核酸切除修復(fù)(NER):NER包括兩條途徑:轉(zhuǎn)錄耦合修復(fù)和全球基因組修復(fù)。ERCC1-XPF復(fù)合物切斷先于XPG，含有重復(fù)序列的單鏈DNA形成發(fā)卡或環(huán)狀的Flap，阻止了XPG的切除，導(dǎo)致重復(fù)序列突變［2］。在不同的研究中，CAG重復(fù)序列傾向于縮減。在人的細(xì)胞中，基因敲除NER的蛋白質(zhì)ERCC1，XPG和CSB時(shí)CAG重復(fù)序列的縮減程度降低［11］。(4)雙鍵斷裂修復(fù)(DSBR):研究表明雙鍵斷裂和重復(fù)序列相關(guān)的復(fù)制異常有關(guān)。復(fù)制中產(chǎn)生的鏈滑動(dòng)和復(fù)制叉暫停會(huì)產(chǎn)生雙鍵斷裂，最終通過(guò)基因交換和單鏈DNA結(jié)合來(lái)修復(fù)。具體將在DNA重組模型中加以闡述。

目前，DNA幾種修復(fù)途徑之間的交聯(lián)與寡核苷酸重復(fù)擴(kuò)展之間的關(guān)系越來(lái)越引起人們的關(guān)注，并且，現(xiàn)在有證據(jù)傾向于認(rèn)為混合途徑更為重要的［12］。比如MSH2-MSH6、BER糖基化酶和MUTYH形成結(jié)構(gòu)復(fù)合體，以及上述的MSH2-MSH3和OGG1之間的關(guān)系來(lái)解釋BER和MMR與寡核苷酸重復(fù)序列長(zhǎng)度變化的關(guān)系。

2.3 DNA重組機(jī)制 基因重組也參與了重復(fù)序列突變的發(fā)生過(guò)程。最簡(jiǎn)單的一種機(jī)制是減數(shù)分裂過(guò)程中同源染色體上的重復(fù)運(yùn)行之間的不平等交換導(dǎo)致擴(kuò)展和縮減。重組修復(fù)模式認(rèn)為DNA重組和DNA合成過(guò)程聯(lián)合，可以導(dǎo)致三核苷酸重復(fù)序列突變擴(kuò)展。研究發(fā)現(xiàn)，重復(fù)序列擴(kuò)展可促進(jìn)自身不平等的姐妹染色單體交換，并且基因轉(zhuǎn)換期間經(jīng)歷了頻繁的擴(kuò)展［13］。另一種機(jī)制是在DNA修復(fù)過(guò)程中形成的單鏈DNA入侵雙鏈中的同源序列引起重復(fù)序列擴(kuò)展。在滯后鏈模板中，通過(guò)一個(gè)可擴(kuò)展的重復(fù)導(dǎo)致復(fù)制叉的拖延而形成一個(gè)穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，由真核細(xì)胞內(nèi)切酶切割和加工這種結(jié)構(gòu)，這個(gè)內(nèi)切酶和細(xì)菌核酸酶SbcCD功能同源，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)3’端重復(fù)序列擴(kuò)展的單鏈DNA片段，能侵入姊妹染色單體，導(dǎo)致重復(fù)序列擴(kuò)展［3］。

3 重復(fù)序列突變導(dǎo)致NDDs的機(jī)制

3.1 疾病相關(guān)基因功能的改變 重復(fù)序列擴(kuò)展導(dǎo)致的突變發(fā)生在編碼區(qū)時(shí)，比如由多谷氨酰胺殘基polyQ片段介導(dǎo)的多聚谷氨酰胺病中，編碼蛋白的谷氨酰胺鏈延長(zhǎng)，導(dǎo)致該蛋白在細(xì)胞內(nèi)累積，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生了某種毒性。目前已經(jīng)證明，polyQ長(zhǎng)度的增加對(duì)細(xì)胞核具有毒性，是導(dǎo)致疾病發(fā)生的一個(gè)重要因素［14］。此外，異常擴(kuò)展的polyQ突變蛋白可能與一種或幾種神經(jīng)元中大量表達(dá)的易損傷的蛋白發(fā)生相互作用，導(dǎo)致選擇性神經(jīng)元核內(nèi)包涵體的形成和神經(jīng)元變性。近年的研究發(fā)現(xiàn)，大量表達(dá)于SCA1患者Purkinje細(xì)胞和其它腦區(qū)的富含亮氨酸的酸性核蛋白就是一種在損傷的神經(jīng)元中大量表達(dá)的蛋白［15］。再者，在HD和SCA1轉(zhuǎn)基因鼠模型以及HD患者的神經(jīng)元中均發(fā)現(xiàn)含有擴(kuò)增的polyQ的細(xì)胞核內(nèi)包涵體［16］，由此推測(cè)這些核內(nèi)包涵體可導(dǎo)致神經(jīng)性失調(diào)或功能障礙。

3.2 異常RNA的產(chǎn)生 DM、FRAXA和FRAXE等疾病的三核苷酸重復(fù)擴(kuò)展位于其致病基因的非翻譯區(qū)。在DM2中，其(CCTG)n擴(kuò)增的重復(fù)片段被轉(zhuǎn)錄為RNA后，突變的RNA會(huì)滯留在核內(nèi)，干擾肌核的正常功能，對(duì)肌纖維產(chǎn)生毒性［17］。其它可能有類似病理機(jī)制的疾病還有SCA8、SCA10、SCA12以及HDL2。

3.3 基因功能的丟失 通過(guò)阻斷或阻礙基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致基因功能的丟失也會(huì)導(dǎo)致NNDs。比如，進(jìn)行性肌陣攣癲癇(EPM1)是由于半胱氨酸蛋白酶抑制劑B(cystatin B)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游啟動(dòng)子中的重復(fù)序列(C4GC4GCG)n發(fā)生擴(kuò)展，阻斷轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄功能喪失而引起的。

3.4 表觀遺傳學(xué)修飾 研究發(fā)現(xiàn)，SCA2致病基因ATXN2啟動(dòng)子區(qū)域CpG的DNA甲基化水平與患者(CAG)n的擴(kuò)展有關(guān)［18］。另外，F(xiàn)RDA患者致病基因fxn位點(diǎn)的核小體核心組蛋白H3的第9位賴氨酸殘基大多處于甲基化修飾狀態(tài)，說(shuō)明FRDA患者細(xì)胞內(nèi)FXN蛋白的編碼基因所在的染色質(zhì)部位是處于抑制狀態(tài)，這樣的染色質(zhì)狀態(tài)可能影響轉(zhuǎn)錄的延伸［19］。在細(xì)胞核內(nèi)，組蛋白乙?；c去乙?；^(guò)程處于動(dòng)態(tài)平衡，Debacker等發(fā)現(xiàn)特殊的HDAC在出芽酵母和人類星形膠質(zhì)細(xì)胞中均能促進(jìn)(CTG)n的擴(kuò)增［20］。

4 總結(jié)與展望

過(guò)去的研究對(duì)重復(fù)序列突變的機(jī)制的理解已有很大提高。給由此引起的神經(jīng)性退行疾病的治療帶來(lái)了希望。如抑制MSH3的活性可使重復(fù)序列縮減同時(shí)不造成整個(gè)染色體的不穩(wěn)定和發(fā)癌的現(xiàn)象。本研究小組發(fā)現(xiàn)利用解旋酶，可消除DNA復(fù)制或修復(fù)中重復(fù)序列產(chǎn)生的發(fā)卡或泡狀結(jié)構(gòu)等二級(jí)結(jié)構(gòu)，阻止重復(fù)序列的擴(kuò)展。通過(guò)特定目標(biāo)假尿苷化實(shí)現(xiàn)翻譯終止。使擴(kuò)展的重復(fù)序列在翻譯時(shí)提前中止，產(chǎn)生正常的產(chǎn)物。研究同時(shí)也顯示出重復(fù)序列突變的復(fù)雜性。部分原因在于重復(fù)序列的突變不是單一機(jī)制完成的，而是多種DNA代謝過(guò)程疊加的結(jié)果。另外變異的發(fā)生對(duì)于不同的階段，組織和細(xì)胞而言是獨(dú)特的。只有把隱藏的由重復(fù)序列突變引起的神經(jīng)退化性疾病的致病機(jī)制逐步理清，才能針對(duì)神經(jīng)退化性疾病加以有效的預(yù)防、早期診斷和治療。因此從基礎(chǔ)研究到開(kāi)發(fā)出對(duì)重復(fù)序列變異引發(fā)的神經(jīng)性退行疾病有效的發(fā)治療方法還有相當(dāng)?shù)穆芬摺?/p>

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