陳預明 陳志林 衛(wèi)恒習 李 莉 張守全

（1華南農業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州 510642；2廣東廣三保養(yǎng)豬有限公司，廣東廣州 510630）

豬早期胚胎發(fā)育調控相關的因子

陳預明1,2陳志林1衛(wèi)恒習1李 莉1張守全1

（1華南農業(yè)大學動物科學學院，廣東廣州 510642；2廣東廣三保養(yǎng)豬有限公司，廣東廣州 510630）

早期胚胎發(fā)育指的是著床前階段胚胎所經歷的生長和分化過程。豬早期胚胎發(fā)育過程是由多種作用因子共同調節(jié)著床前胚胎的生長和分化，從而保證胚胎的正常發(fā)育。在此過程中，相關因子的調控起著關鍵性的作用，不僅可以促進胚胎正常的著床，也能夠誘導功能異常的胚胎凋亡，降低子代的畸形率。本文主要對幾類與調控相關的因子作簡要概述，以說明其在豬早期胚胎發(fā)育過程中所發(fā)揮的功能性作用，同時也為相關學者提供簡單的參考。

豬；早期胚胎；發(fā)育；調控因子

豬早期胚胎的發(fā)育是指著床前階段胚胎所經歷的生長和分化過程，時間約為12天。研究表明在早期胚胎發(fā)育過程中可以檢測到許多與胚胎生長發(fā)育相關的基因或蛋白調控因子。這些因子不僅可以促進胚胎正常的著床和發(fā)育，也能夠誘導異常胚胎的凋亡[1]。此外，弄清其基因的表達調控，對于研發(fā)適合豬胚胎干細胞維持其多能性的培養(yǎng)基顯得猶為重要。近年來，隨著早期胚胎作為細胞形態(tài)發(fā)生和分化模型的重要性日益增加，越來越多的作用因子被發(fā)現(xiàn)與早期胚胎發(fā)育相關。因此，本文對豬早期胚胎發(fā)育過程中主要的幾類因子表達簡要概述，以說明這些因子所發(fā)揮的重要作用。

1 原癌基因

豬原癌基因是一種酪氨酸激酶受體，為單拷貝基因，全長大約200 kb，由21個外顯子組成，整個編碼序列長2 919 bp[2]。SakuraiMt等采用熒光原位雜交技術證實了原癌基因位于8號染色體短臂1.2區(qū)（8p l2），同時也發(fā)現(xiàn)原癌基因是一個可以控制毛色的基因[3]。此外，其對豬的造血和繁殖效應也有一定影響。

1.1原癌基因對豬毛色的影響

豬毛色的顯性白表型往往是原癌基因的基因突變造成的[2]。原癌基因基因內含子17的第1個核苷酸處發(fā)生G→A剪接突變，導致皮膚和毛囊不能生成黑色素細胞而產生白色[4]。SakuraiMt等研究指出豬的顯性白毛色主要由原癌基因基因（I位點）調控[3]，但師科榮等的研究發(fā)現(xiàn)白毛產生的現(xiàn)象并不是全部由原癌基因基因內含子17中G→A的突變和內含子18中的AGTT缺失所導致，同時也存在其他區(qū)域且未被發(fā)現(xiàn)的決定性SNP（Sing le Nuc leotide Polymorphisms，即在基因組上單個核苷酸的變異）[2]。然而這種SNP很可能是導致榮昌豬白毛色形成的主要原因。隨后白小青和Lai等的研究結果也分別證實了榮昌豬白毛色并不是由于原癌基因基因內含子17和18這兩個位點突變引起[5-6]。

1.2原癌基因對豬造血效應的影響

原癌基因造血干細胞因子受體為酪氨酸蛋白激酶受體，其產物廣泛存在于造血干細胞表面，特別是早期胚胎的造血干細胞表面，扮演著傳遞生物信號的重要角色。一旦與配體SCF（stem cell fac tor）結合后，可激活多種信號轉導通路，使其他造血生長因子對造血細胞的作用得以增加，并對造血細胞的凋亡、增生、分化和轉移進行調控[7]，但潛在機制仍不清楚。原癌基因的突變將會導致貧血病，外周血液中的紅細胞、白細胞、血紅蛋白和血小板等生化指標均比正常值低。如果SCF/原癌基因異常則會引起造血微環(huán)境紊亂，原癌基因的無義突變可導致其功能完全喪失，大大減少紅細胞的生成量。畜牧業(yè)生產中白毛豬新生仔豬患貧血的比例要比有色豬高，繼而引起以下一系列問題：母豬貧血則易不孕、產仔數(shù)減少和仔豬發(fā)育遲緩；初生仔豬貧血則精神不振、活力減弱甚至吮乳力不足，消瘦、皮膚和黏膜蒼白、下?。簧L肥育豬貧血可致其生長發(fā)育滯后，生產性能降低。仔豬貧血發(fā)病率超過30%，由此導致的死亡率超過15%，導致生豬生產遭受巨大的經濟損失[8]。

1.3原癌基因對豬繁殖效應的影響

原癌基因參與動物生殖細胞的形成、發(fā)育和存活過程的調控，對繁殖起著必不可少的作用。原癌基因突變的豬在純合狀態(tài)下是完成可育的、不致死的[4]，這對養(yǎng)殖生產的影響極大。原癌基因在原始生殖細胞、A型精原細胞、精子細胞的頂體及其顆粒均有表達，有利于減數(shù)分裂的完成[9]。研究表明原癌基因突變后睪丸中分化的精原細胞明顯減少，并在精子發(fā)生過程中發(fā)揮決定作用[10]。由于編碼SCF/原癌基因位點的突變，因此將直接影響生精細胞的發(fā)育。此外原癌基因在卵母細胞和內膜細胞內也有表達，其受體在卵泡發(fā)育過程中的原始卵母細胞和生長卵母細胞及卵泡膜間質細胞中表達。攜帶原癌基因突變基因純合子的雌性動物大多數(shù)表現(xiàn)為不育。Fesus等發(fā)現(xiàn)I/I型的公豬睪丸比其他型的公豬睪丸要大，I/I型母豬卵巢的各項參數(shù)值均是所有原癌基因型豬中最小的，但其退化和萎縮的卵泡數(shù)量是最多的[4]。

2 白血病抑制因子

白血病抑制因子（Leukaem ia Inhibitor Fac tor,LIF）為白介素6（IL-6）家族中的一員，是典型的多功能生長因子，對于細胞生長、增殖與分化有著廣泛的作用，同時與胚胎發(fā)育、神經發(fā)育和造血系統(tǒng)的發(fā)育有密切聯(lián)系[11]。LIF是目前研究最多、應用最廣的一種胚胎干細胞（ES）分化抑制因子，主要應用于胚胎干細胞的體外培養(yǎng)和研究。豬的LIF基因長約6.3 kb，有5個外顯子，其染色體位置為14q2.1-q2.2。目前已發(fā)現(xiàn)兩個單核苷酸多態(tài)點（SNP），其中一個位于外顯子1，另一個位于外顯子3的UTR區(qū)[12]。豬LIF基因在胚胎附植前的子宮內膜表達，而胚胎表達LIF的受體[13]。Hall等研究表明豬LIF因子可與ES細胞表面的LIFR/gp130受體結合[14]。隨后Wianny等則證實了LIF因子與LIFR/gp130結合后可以激活JAK-STAT3通路[15]。

一般而言，母豬的胚胎損失率約為40%，而附植前胚胎死亡率約為20%[16]，是產前損失最嚴重的階段[17]。Spotter等利用德國大白和杜洛克合成系母豬進行研究發(fā)現(xiàn)在第一胎母豬中LIF基因AB型母豬（外顯子3 SNP，下同）的產仔數(shù)顯著低于AA或BB型母豬[18]，呈負顯性效應（P＜0.05）；同時也發(fā)現(xiàn)在德國長白第一胎母豬中AB型母豬產活仔數(shù)顯著高于其他基因型的母豬，突變純合子產活仔數(shù)最低[19]，然而在大白母豬的差異不顯著。但Lin等發(fā)現(xiàn)在我國廣東某豬場中大白母豬的BB型產活仔數(shù)顯著高于AB型[20]。另外張豪等在2011年也發(fā)現(xiàn)我國溫氏豬場長白母豬AA和AB基因型母豬產仔數(shù)接近，均顯著或極顯著高于BB基因型，且第一胎A等位基因的效應高于其他胎次[21]。雖然目前研究的結果不盡相同，但主要原因很可能是由于所研究的SNP與性狀處于不同的連鎖相，而我們可以肯定的是LIF基因可作為影響豬產仔數(shù)的候選基因。

3 胰島素生長因子

胰島素生長因子（insulin-like g row th factor,IGF）是多肽生長因子，IGF-I、IGF-II及各自受體和結合蛋白（IGFBP1-7）構成IGF系統(tǒng)。IGF-I和IGF-II分別由70和67個氨基酸組成，在豬的卵巢、子宮、輸卵管和早期胚胎中均有表達。通過內分泌、旁分泌或自分泌，IGF與靶細胞表面的特異受體結合起到調節(jié)相應組織生長發(fā)育的作用。與此同時也可以影響母豬的卵巢功能、子宮發(fā)育、促進卵母細胞和囊胚發(fā)育、參與胚胎雌激素的生成、調節(jié)子宮中的基因表達和影響胚胎的著床[22]。

豬妊娠前期即胚胎早期，IGF-I能夠刺激卵巢細胞產生孕烯醇酮和孕酮，能與FSH協(xié)同作用，促進孕酮生成。豬胚胎快速延長期的子宮腔液中存在IGF-I、IGF-II，能夠控制子宮細胞的增殖和分化，重塑子宮內環(huán)境，做好囊胚附植的準備。Geisert等研究表明，母豬妊娠10天左右子宮液中主要的結合蛋白是IGFBP-2和IGFBP-3，隨著組織激肽釋放酶活性的增加，在激活細胞間質中金屬蛋白酶作用下分解IGFBP-2和IGFBP-3，使子宮釋放IGF-I和IGF-II到子宮腔中促進胚胎發(fā)育[23]。同時Green等也發(fā)現(xiàn)子宮內膜IGF-I通過參與調節(jié)胚胎細胞色素P450芳香酶mRNA的表達量來調節(jié)雌激素的生成，從而維持胚胎的生長發(fā)育[24]。另外Sallaberry等研究結果顯示IGF-I對SSAT的短期調節(jié)可使IGF-I與胚胎細胞因子參與妊娠早期母豬子宮內膜與孕體發(fā)育的調節(jié)，從而影響附植胚胎的發(fā)育[25]。

4 轉錄因子

豬早期胚胎中，有三種轉錄因子表達，分別是Oct4、Sox2和Nanog。這三種因子共同作用于早期胚胎，但時間上和組織上的表達與人和小鼠有明顯差異[26]。其中Oct4是由POU5F1基因編碼產生，是含POU結構域的轉錄因子家族中的一員，是最早發(fā)現(xiàn)的多能性基因。Sox2基因是繼Oc t4之后發(fā)現(xiàn)的重要多能性基因，其通過結合DNA上保守序列來調控基因表達，表達于內細胞團、上胚層、生殖細胞和胚外外胚層中。隨著組織分化的進行，Sox2表達逐漸減弱。另外Nanog是維持表皮干細胞（ep idermalstem cells,ESCs）全能性的又一重要轉錄因子，表達于小鼠胚胎發(fā)育早期致密型桑椹胚的內部以及囊胚中的內細胞團，Nanog在分化細胞中呈現(xiàn)低表達或不表達狀態(tài)。研究表明敲除Oct4的小鼠胚胎在著床前期出現(xiàn)異常[27]；敲除Sox2基因的小鼠胚胎能著床，但隨后會發(fā)生死亡。Sox2因子缺失的胚胎，上胚層嚴重丟失，且胚外的組織結構紊亂[28]；敲除Nanog基因的小鼠胚胎在著床后很快死亡。

2009年，Hall等[14]研究發(fā)現(xiàn)豬胚胎形成5～6天后，無論囊胚還是內細胞團均缺少Nanog和Sox2的表達，然而Puy等[29]研究表明在8.5天內細胞團時期和10.5天外胚層時期，Oc t4在滋養(yǎng)層核心細胞內均有表達，但在內細胞團和外胚層無表達；而Nanog則在這兩個胚齡的內細胞團和外胚層表達，相反地在滋養(yǎng)層和內胚層內無表達；Sox2的表達模式更是嚴格地受內細胞團和外胚層控制。可見Oc t4、Sox2和Nanog隨著胚齡的差異表達的量和組織均有所不同。多個研究發(fā)現(xiàn)僅在豬外胚層10天時，Oc t4、Nanog和Sox2才共同表達[29]。豬早期胚胎囊胚和內細胞團中有著與靈長類和小鼠不同的獨一無二的表達圖譜，但是這些轉錄因子在不同物種間外胚層中的表達則趨于相同[29]。但無論如何，這三種因子對培養(yǎng)胚胎干細胞（emb ryonic stem cell,ES）的作用是毫無疑問的，添加與否直接影響ES細胞是否能夠維持多能性[30]。

Oct4、Sox2和Nanog是研究最詳細的多能性基因之一，三者均通過正反饋調控了自身的表達，而自身的表達還受到其他兩者的正調控，三者或許通過這種正反饋調控機制以及對相同靶基因的調控，建立了表達和功能上的彼此聯(lián)系。2009年，張鑫淼實驗結果證明豬Oct4基因過表達能夠在成纖維細胞中上調多個多能因子，其中Sox2表達量提高了3倍，Nanog基因的表達量上調4倍左右[28]。這也證明了在誘導重編程中Oc t4基因同樣具有激活多種因子的表達作用，同時Oct4的單獨作用也可實現(xiàn)促進相關基因的高度表達。

5總結

本文主要對與豬早期胚胎發(fā)育相關的原癌基因、白血病抑制因子、胰島素生長因子和若干轉錄因子進行綜述，以說明其在豬早期胚胎正常發(fā)育過程中發(fā)揮重要的功能性作用。這些因子在豬胚胎著床前對胚胎的生理功能進行嚴密調控，同時也參與早期胚胎的生長發(fā)育和凋亡等。胚胎著床前相關因子的調控關系到豬胚胎損失率的高低，同時也影響子代的生理功能。弄清這類因子的調控模式，不但可以有助于豬ES細胞的體外培養(yǎng)，也有助于生產上減少胚胎凋亡，從而提高子代的存活率，提高養(yǎng)殖業(yè)的生產效率。

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