楊 磊，王曉明

(中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科，陜西 西安 710032)

作為哺乳動物基本單位的細(xì)胞，其內(nèi)外存在各種離子(Na+，K+，Cl－)，其環(huán)境變化是導(dǎo)致疾病的基礎(chǔ)。除陽離子外，陰離子也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Cl－是體內(nèi)最豐富的陰離子，它進(jìn)出細(xì)胞的過程，除 Cl－－HCO3－交換及 Na+－Cl－，Na+－K+－2Cl－和 K+－Cl－聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)外，經(jīng)過陰離子通道進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)是重要方式之一，由于在生理條件下陰離子通道介導(dǎo)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)主要為Cl－，所以通常稱為氯離子通道。氯離子通道廣泛存在于各種細(xì)胞上，但因其電導(dǎo)較小、研究難度較大以及缺乏特異性抑制劑等因素，使其相關(guān)研究存在很多問題。隨分子生物學(xué)和電生理方法的結(jié)合，氯離子通道的研究進(jìn)入了快速發(fā)展時期。同時，隨著新藥創(chuàng)新的研發(fā)，與其相關(guān)的中藥單體研究也成為焦點(diǎn)。心臟Cl－通道研究發(fā)現(xiàn)了6種不同的 Cl－電流[1－2]，目前認(rèn)為存在4種 Cl－通道，即 CFTR 基因編碼的Cl－通道，ClC－3編碼的，ClCA1編碼的，ClC－2編碼的。其中與ClC－3密切相關(guān)的容積敏感性外向整流氯離子通道(VSOR)在維護(hù)和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用[3]，并與細(xì)胞的退行性改變及存亡密切相關(guān)。

1 生理學(xué)特性及生物電活動

VSOR電流廣泛表達(dá)于幾乎所有脊椎動物的細(xì)胞中，在維持細(xì)胞正常容積的動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用[4]。在細(xì)胞的體積增大及調(diào)節(jié)性容積減小(RVD)過程中，VSOR發(fā)揮核心作用，RVD的完成主要通過氯通道和鉀通道使Cl－和K+外流，而完成細(xì)胞容積減小的過程。目前認(rèn)為，在心肌細(xì)胞，容積調(diào)控氯電流不僅對生理狀態(tài)下細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)起重要作用，而且與心肌細(xì)胞的多種病理生理過程有關(guān)。

在哺乳動物，細(xì)胞腫脹后都能激活典型的陰離子電流，在生理條件下，該電流主要為Cl－，所以通常稱為容積調(diào)控氯電流。該電流典型的生物物理學(xué)特點(diǎn)為[5]:1)通道的離子選擇性通透順序為 SCN－＞I－＞NO3－＞Br－＞Cl－＞F－＞gluconate－[6]，對較大的陰離子如天冬氨酸、谷氨酸、氨基乙磺酸均有通透性;2)該電流的激活是非電壓依賴性的，但在電壓超過+60 mV時，出現(xiàn)緩慢失活，在負(fù)電壓時，該電流快速復(fù)活;3)雖然胞外Cl－濃度高于胞內(nèi)，但由于平衡電位的存在，該電流表現(xiàn)為輕度的外向整流特性，去極化時無明顯的時間依賴性。在一些細(xì)胞，可能由于通道蛋白有所不同，Icl，vol沒有明顯的整流和失活過程;4)在牛肺動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，正電壓時單通道電導(dǎo)是4～40 pS，在負(fù)電壓時電導(dǎo)為4～10 pS，需要注意的是，VSOR并非唯一的腫脹激活的氯通道;5)無特異性阻斷劑，VSOR最有效的阻斷劑有4，4'－二異硫氰基芪 －2，2'－二磺酸 (4，4'－diisothiocyanatostilbene－2，2'－disulfonate，DIDS)、5－硝基 －2－(3－苯丙胺)－苯甲酸[5－nitro－2－(3－phenylpropylamino)－benzoic acid，NPPB]、雌激素受體拮抗劑他莫昔芬(tamoxifen)。他莫昔芬最開始用作雌激素受體阻斷劑，后來發(fā)現(xiàn)它能特異性地抑制Icl，vol，其他一些阻斷劑，如蒽－9－羧 酸 (anthracene－9－carboxylic acid，9－AC)、尼 氟 滅 酸(niflumic acid，NFA)、氟芬那酸 (flufenamic acid，F(xiàn)FA)、格列苯脲(glibenclamide)、IAA－94也能抑制VSOR氯通道。

2 調(diào)節(jié)作用機(jī)制

Duan等[7]通過對心臟糖蛋白、ClC－3在NIH/3T3成纖維細(xì)胞上的克隆表達(dá)試驗發(fā)現(xiàn)了與Icl，vol一致的容量敏感度氯電流。蛋白激酶C(PKC)和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶可以調(diào)節(jié)此電流，ClC－3抗體可以產(chǎn)生抑制作用。各種因素導(dǎo)致的細(xì)胞容量變化通過信號級聯(lián)放大調(diào)節(jié)Icl，vol、PKC、酪氨酸蛋白激酶的磷酸化及細(xì)胞骨架可對其產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。在雞心臟的Icl，vol研究中，研究者發(fā)現(xiàn)抑制酪氨酸蛋白激酶可以減弱Icl，vol，經(jīng)PKC抑制劑處理的細(xì)胞在PKC激活劑作用下無Icl，vol產(chǎn)生，使用細(xì)胞松弛素B破壞絲狀肌動蛋白，細(xì)胞外低滲不能激活I(lǐng)cl，vol，說明酪氨酸蛋白激酶、PKC、細(xì)胞骨架都是Icl，vol調(diào)節(jié)中的重要因素[8]。磷酸化在 VSOR激活中的作用還有待于證實。

Crepel等[9]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖與酪氨酸激酶激活VSOR有關(guān)。其他研究者也發(fā)現(xiàn)了酪氨酸磷酸化的作用。與此同時，Lepple－Wienhues等[10]研究發(fā)現(xiàn)，p56Ick激酶調(diào)整酪氨酸磷酸化參與了細(xì)胞容積調(diào)節(jié)過程，敲出p56Ick的細(xì)胞無法記錄到容積調(diào)控氯電流，但在轉(zhuǎn)染野生型DNA或在剪切的膜片上加入該激酶后，該電流又出現(xiàn);另外，低滲腫脹時該激酶的活性增高。有報道顯示，Icl，vol在鼠成纖維細(xì)胞，磷酸酪氨酸磷酸酶抑制劑能抑制RVD與氯電導(dǎo)[11]。研究表明，加入GTP可使Icl，vol時程延長，而加入GDPβγ則抑制該電流。他們得出結(jié)論，VSOR激活機(jī)制中有G蛋白參與[12]。在胞內(nèi)ATP處于低水平時，Mg升高能抑制 Icl，vol細(xì)胞內(nèi)Cl－濃度增高時，將出現(xiàn)VSOR的激活容積增大或活性降低[13]。一些蛋白激酶通路在VSOR激活中的作用被廣泛研究。其中，cAMP和cAMP依賴的PKA磷酸化對Icl，vol的作用存在著許多爭議[14]。十字胞堿(STS)可能通過PI3K/Ak機(jī)制激活心肌細(xì)胞容積敏感性外向整流氯離子通道[15]。

3 對細(xì)胞凋亡的影響

凋亡是活體內(nèi)個別細(xì)胞的程序性死亡，是因體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致細(xì)胞主動性死亡的形式。凋亡性細(xì)胞皺縮(AVD)，是細(xì)胞凋亡的一個普遍且重要的特征，而維持細(xì)胞體積恒定，VSOR起著重要作用[16]。當(dāng)細(xì)胞處于低滲環(huán)境中，由于滲透壓的作用，水被動流入細(xì)胞，腫脹的細(xì)胞可激活氯離子通道開放，從而使胞內(nèi)大量離子及水分外流，最終使細(xì)胞回復(fù)其原來的體積大小，這種細(xì)胞腫脹后發(fā)生的容積減小即調(diào)節(jié)性容積回縮。

研究表明，在小鼠心房肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中，提高VSOR氯通道電流可加速RVD過程[17]。當(dāng)細(xì)胞處于高滲環(huán)境中，由于滲透壓的作用，水被動流出細(xì)胞，細(xì)胞發(fā)生皺縮，為了重新達(dá)到“正?！比莘e，細(xì)胞會發(fā)生調(diào)節(jié)性容積增大(RVI)。RVI的發(fā)生主要與Na+－K+－2Cl－同向轉(zhuǎn)運(yùn)體，Na+－Cl－同向轉(zhuǎn)運(yùn)體和 Na+/H+交換體等有關(guān)[18]。

已有研究表明，VSOR參與了RVI的發(fā)生，而且高滲環(huán)境中氯離子電流的減少可反映出VSOR活動受抑制[19]。AVD的發(fā)生主要和容積調(diào)節(jié)性K+和Cl－通道的激活有關(guān)。AVD的誘導(dǎo)伴隨著RVD的易化，在此過程中總是伴隨有容積調(diào)節(jié)性K+和Cl－通道的激活，Cl－通道的活動可能是AVD的一個必要條件。

4 與心血管疾病的關(guān)系

目前，主要認(rèn)為氧自由基、鈣超載、活化的中性白細(xì)胞、心肌纖維能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞、一氧化氮、細(xì)胞黏附因子和細(xì)胞凋亡等都可能參與心肌缺血－再灌注損傷(MI/R)的發(fā)病過程[20]?，F(xiàn)已證實，在MI/R中存在激活VSOR，通過RVD和缺血時產(chǎn)生的親脂代謝物及細(xì)胞內(nèi)外氯離子濃度變化影響氯離子通道。研究發(fā)現(xiàn)，VSOR的非選擇阻滯劑DIDS或NPPB可以減少再灌注期的細(xì)胞凋亡數(shù)，但對缺血期影響不大;說明VSOR參與了缺血－再灌注引起的細(xì)胞凋亡過程的調(diào)節(jié)[21]。

氯離子通道阻滯劑DIDS具有保護(hù)MI/R損傷的作用，可減少再灌注后的心律失常、抑制心肌酶釋放和改善心臟的功能，并且在MI/R誘導(dǎo)的凋亡性心肌細(xì)胞損傷中，氯離子通道阻滯劑也能有效地抑制Caspase－3活性，保護(hù)受損的心肌細(xì)胞。Liu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，DIDS抑制心肌細(xì)胞凋亡可能與抑制促凋亡分子Bax由胞質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)位有關(guān)。

5 針對VSOR發(fā)揮作用的藥理學(xué)研究

基于近年來對氯離子的深入探索，不管是基礎(chǔ)研究還是臨床研究，都說明VSOR與人類疾病息息相關(guān)。阻斷氯離子通道會對缺血性心肌病起到保護(hù)作用，但針對其通道阻滯劑尚無特異性的藥物發(fā)現(xiàn)，其非特異阻滯劑較多，且被廣泛應(yīng)用于各種研究試驗，不同細(xì)胞要選用不同的阻滯劑。Cl－電流參與動作電位，阻斷其可延長動作電位時程起到抗心律失常的作用，這可能成為新一代抗心律失常藥物的突破口。到目前為止，對于陰離子通道，實現(xiàn)特異性激活或阻斷并不容易。大多數(shù)氯離子通道阻滯劑或激活劑都不是高特異性的，所以使用這些阻斷劑或激動劑必然會出現(xiàn)很多負(fù)作用。由此可見，通過離子通道學(xué)研究篩選高特異性阻滯劑或激動劑是藥理學(xué)研發(fā)的焦點(diǎn)。

近年來，隨著科技的進(jìn)步，藥物分析學(xué)、化學(xué)、生理學(xué)等學(xué)科參與了中藥的研發(fā)，對中藥的認(rèn)識有了進(jìn)一步的深入[23]。中藥單體制備成為醫(yī)藥界的潮流及焦點(diǎn)，對中藥單體的研究需要借助現(xiàn)代手段和技術(shù)，根據(jù)細(xì)胞膜色譜法[24]在細(xì)胞水平篩選的獨(dú)特優(yōu)勢，對其中藥有效成分進(jìn)行篩選和驗證。加之臨床上多種中藥廣泛應(yīng)用于治療心血管疾病，如丹參具有擴(kuò)張血管、降壓、抗血栓的作用，對冠心病、心絞痛、心動過速有明顯療效。近年來，高效小分子組合化合物和天然化合物對VSOR功能的調(diào)節(jié)作用成為研究的熱點(diǎn)。

VSOR對維持細(xì)胞容積平衡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、影響細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞的電活動等多種生物功能發(fā)揮重要作用。近年來，人們發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可能通過某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活細(xì)胞膜氯離子通道，誘發(fā)細(xì)胞凋亡性容積減小，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該中藥單體也通過膜片鉗技術(shù)得到了驗證[25]。利用氯離子通道細(xì)胞熒光測定模型和電生理測定分析，從中藥單體化合物中發(fā)現(xiàn)并研究了天然小分子化合物人參皂苷元－20(S)－原人參二醇(protopanaxadiol)對野生型和AF508突變型CFTR Cl－通道的激活作用[26－27]。

6 展望

在過去20多年中，心臟氯離子通道的研究經(jīng)歷了一次從新發(fā)現(xiàn)和快速發(fā)展的時期，無論通道功能還是調(diào)節(jié)機(jī)制方面都取得了重要進(jìn)展，但對心肌氯離子通道的認(rèn)識還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于陽離子通道。尤其在VSOR分子結(jié)構(gòu)、基因定位研究方面，至今尚未確定。最近一項研究表明，TMEM16F是Ca2+激活Cl－通道的一個組成部分，但不是容積敏感性外向整流氯離子通道[28]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和膜片鉗的應(yīng)用，離子通道的結(jié)構(gòu)和功能研究可望得到進(jìn)一步發(fā)展，也必定能極大地促進(jìn)心臟氯離子通道的研究和發(fā)展。

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