房海波， 王維平， 王洪超， 臧紅敏， 甄軍麗， 馬彩云， 王 偉

癲癇(Epilepsy)是一種常見的、慢性反復發(fā)作的神經(jīng)系統(tǒng)綜合征，可導致嚴重的神經(jīng)元凋亡或壞死，從而影響患者的認知功能和社會生活，并給家庭和社會帶來沉重的負擔。因此，深入研究癲癇發(fā)作后神經(jīng)元凋亡的分子機制，探索有效的抗凋亡藥物具有重要的意義。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族的成員之一，當受到各種應(yīng)激刺激時p38MAPK被激活，進而通過多條信號轉(zhuǎn)導通路引起神經(jīng)元凋亡。α-硫辛酸(α-lipoic acid，α-LA)是一種強效的天然抗氧化劑，在神經(jīng)變性疾病、缺血再灌注損傷、多發(fā)性神經(jīng)病等疾病中發(fā)揮顯著的抗氧化作用。然而，其在癲癇和凋亡方面的研究還很少。本實驗應(yīng)用α-LA對杏仁核電點燃大鼠進行干預(yù)，通過觀察大鼠行為學表現(xiàn)，檢測海馬p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達水平及海馬神經(jīng)元凋亡率，從而初步探討α-LA發(fā)揮神經(jīng)保護的效果及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 電極植入過程及檢測 點燃前后發(fā)放閾值(afterdischarge threshold，ADT)大鼠麻醉后固定于腦立體定位儀上，刺激電極插入左側(cè)杏仁核(前囟后 2.8 mm，左旁開 4.8 mm，顱骨下 8.6 mm)，腦電圖描記電極、參考電極和接地電極分別插入右額部、左、右側(cè)頂枕交界區(qū)，插入深度為顱骨下接近硬腦膜即可，牙托樹脂和502膠水固定，恢復1 w，檢測點燃前ADT(刺激參數(shù)為:單向方波脈沖，脈沖持續(xù)時間1.0 ms，頻率 60 Hz，串持續(xù)時間為 1.0 s。刺激電流強度從100 uA開始，每隔5 min增加40 uA直至腦電圖上出現(xiàn)至少持續(xù)3 s的后放電為止。刺激電流強度超過700 uA仍未出現(xiàn)后發(fā)放的大鼠將被剔除)。

1.2 動物分組及模型制備 雄性Wistar大鼠36只，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，起始體重280±20 g，SPF級。隨機分為以下6組，每組6只。正常對照組:不給予任何處理;α-LA組:每天給予α-LA(40 mg/kg)(德國史達德大藥廠)腹腔注射一次;假手術(shù)組:杏仁核植入電極后不給予任何處理;電刺激模型組(ES組):植入電極后每天以120%的點燃前ADT刺激一次;電刺激+α-LA低劑量組(電低α-LA組):植入電極后每天給予α-LA(20 mg/kg)腹腔注射30 min后以120%的點燃前ADT刺激一次;電刺激+α-LA高劑量組(電高α-LA組):植入電極后每天給予α-LA(40 mg/kg)腹腔注射30 min后以120%的點燃前ADT刺激一次，連續(xù)刺激15 d。依據(jù)Racine評價標準觀察大鼠的行為學表現(xiàn)，記錄每只大鼠第一次達到每個發(fā)作等級所需的累積刺激數(shù)及累積后發(fā)放持續(xù)時間(duration of afterdischarges，ADD)。最后一次刺激結(jié)束后按檢測點燃前ADT的方法檢測ES組、電低α-LA組和電高α-LA組的點燃后ADT。

1.3 Western blot檢測海馬 p38MAPK及 pp38MAPK的表達水平 模型制備完成后，每組6只大鼠均采用斷頭取腦并快速分離海馬，提取總蛋白，測蛋白濃度，取50μg蛋白95℃ ～98℃變性5 min，以非連續(xù)Tris-SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。脫脂奶粉室溫封閉1 h，兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗體(1:300，美國Bioworld公司)、兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗體(1:300，美國Bioworld公司)4℃過夜，漂洗5次，山羊抗兔IgG熒光抗體(1:4000，Rockland公司)室溫避光1 h，漂洗5次，遠紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(Odyssey公司)掃描并測定目標蛋白單位光密度值，與GAPDH(1:400，美國Bioworld公司)比值后，做統(tǒng)計學分析。

1.4 碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色檢測海馬神經(jīng)元凋亡率 海馬組織置放于70% 乙醇中4℃保存24 h，將組織置于180目鋼絲濾網(wǎng)上，剪碎組織后用小鑷子輕輕搓組織，邊搓邊用生理鹽水沖洗，將沖洗液轉(zhuǎn)移到塑料試管內(nèi)，過濾沖洗液一次，4℃，1000 rpm，離心4 min，留取沉淀，加入500 μl PI染液，4℃冰箱靜置30 min后檢測。

1.5 統(tǒng)計學分析 實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差(χ±s)表示，運用Spss13.0軟件進行處理，采用完全隨機設(shè)計資料方差分析和配對t檢驗進行顯著性差異分析，運用SNK法檢驗進行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 行為學檢測結(jié)果 (1)與ES組相比，電高α-LA組達到第一次Ⅴ級發(fā)作所需的累積刺激數(shù)明顯增多(P＜0.05)，點燃后 ADT明顯增高(P＜0.05)。ES組、電低α-LA組和電高α-LA組達到第一次Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級發(fā)作所需的累積刺激數(shù)之間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(2)與ES組相比，電低α-LA組和電高α-LA組達到第一次Ⅴ級發(fā)作所需的累積ADD明顯縮短(P＜0.05)。ES組、電低α-LA組和電高α-LA組達到第一次Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級發(fā)作所需的累積ADD之間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(3)ES組、電低α-LA組和電高α-LA組點燃后ADT較點燃前ADT明顯降低(P＜0.05)。

2.2 Western Blot結(jié)果 各組之間 p38MAPK表達水平的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。電低α-LA 組(2.20 ±0.04)和電高 α-LA 組(1.26 ±0.93)的 p-p38MAPK表達水平較 ES組(3.39±0.09)明顯降低(P＜0.05);并且電低 α-LA組的海馬p-p38MAPK表達水平明顯高于電高α-LA組(P＜0.05)。ES組、電低α-LA組和電高α-LA組海馬p-p38MAPK表達水平明顯高于正常對照組(0.62±0.05)、α-LA 組(0.64 ±0.05)和假手術(shù)組(0.56 ±0.06)(P ＜0.05)。

2.3 細胞凋亡率檢測結(jié)果 電低 α-LA組(11.71 ±0.52)和電高 α-LA 組 (8.65 ±0.38)的海馬神經(jīng)元凋亡率較ES組(14.83±0.60)明顯降低(P＜0.05);并且電低α-LA組海馬神經(jīng)元凋亡率明顯高于電高α-LA組(P＜0.05)。ES組、電低α-LA組和電高α-LA組的海馬神經(jīng)元凋亡率明顯高于正常對照組 (1.72 ±0.46)、α-LA 組 (1.53 ±0.37)和假手術(shù)組(1.91 ±0.60)(P ＜0.05)。

3 討論

癲癇發(fā)作可致腦部神經(jīng)元凋亡，海馬等邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)元凋亡尤為明顯［1］。神經(jīng)元凋亡可導致神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生、苔蘚纖維出芽及海馬硬化，進而促進癲癇發(fā)展。癲癇動物模型具有與人類癲癇相似的行為和腦電圖特征，電點燃是目前普遍采用的動物模型制備方法，該模型具有如下優(yōu)點:(1)一旦建立，腦內(nèi)興奮性神經(jīng)元可保持數(shù)月;(2)在發(fā)作行為、癇樣放電擴散及腦電圖等方面與人類癲癇相似;(3)電極位置可由實驗者自由選擇，以便控制癲癇灶的位置;(4)發(fā)作時間容易控制，重復性好;(5)動物對刺激反應(yīng)性好，死亡率低。因此，本實驗采用杏仁核電點燃方法制備慢性癲癇大鼠模型。

α-硫辛酸(α-LA)是天然抗氧化劑中作用最強的一種，也是存在于多種酶復合物中的天然輔因子［2］。在許多類型細胞中，α-LA對活性氧簇誘導的凋亡具有保護作用。α-LA既具有水溶性又具有脂溶性，這一重要的特性使得它能夠順利通過血腦屏障從而保護腦內(nèi)的神經(jīng)元［3］。已有研究表明，α-LA能夠通過降低興奮性氨基酸水平并提高抑制性氨基酸水平來發(fā)揮癲癇后的神經(jīng)元保護作用［4］。本實驗結(jié)果表明，與ES組相比，應(yīng)用α-LA干預(yù)后癲癇發(fā)作等級降低，達到相同發(fā)作等級所需的累積刺激數(shù)增加、累積ADD縮短，點燃后的ADT增高，其原因可能為α-LA能夠減少癲癇發(fā)作后神經(jīng)元的凋亡數(shù)量，從而降低大鼠對電刺激的敏感性，故達到相同的發(fā)作等級需要更多的電刺激數(shù)。同時受到相同強度的刺激后，比ES組大鼠更難于發(fā)作，故點燃后的發(fā)放閾值增高。由于α-LA干預(yù)的大鼠每次的ADD都比ES組短，因此達到相同的發(fā)作等級所需的累積ADD也比ES組縮短。

p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族中的重要成員之一，其催化域內(nèi)的VII和VIII子域之間具有蘇氨酸-甘氨酸-酪氨酸(TXY)雙重磷酸化結(jié)構(gòu)域［5］。通常情況下，p38MAPK按下列方式次序激活:MAPKKK-MAPKK-p38MAPK［6］，MKK3 和 MKK6是激活p38MAPK的兩種相對特異性的絲裂原活化蛋白激酶激酶［7］。此外，p38MAPK還能夠通過非依賴 MAPKK的機制發(fā)生自動磷酸化［8］。通常，p38MAPK以無活性的形式存在于細胞質(zhì)內(nèi)，當被激活后轉(zhuǎn)化為具有活性的磷酸化形式［9］。研究表明，神經(jīng)生長因子剝奪及Fas結(jié)扎誘導的細胞凋亡中都存在P38MAPK的激活［10］，P38MAPK的特異性抑制劑SB203580能夠抑制水楊酸鈉誘導的FS-4纖維母細胞凋亡［11］及谷氨酸鹽誘導的小腦顆粒細胞凋亡［12］。由此表明，p38MAPK與凋亡之間存在著密切關(guān)系。在凋亡反應(yīng)中p38MAPK通路的功能即可以是caspase的上游也可以是其下游。此外，p38MAPK還可以通過激活p53、促進氧自由基和彈性蛋白酶的釋放、上調(diào)TNFα的活性等方式參與調(diào)節(jié)細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作后海馬組織內(nèi)p-p38MAPK蛋白表達水平明顯上調(diào)且海馬神經(jīng)元凋亡率明顯增加，應(yīng)用α-LA干預(yù)后能劑量依賴性地降低海馬組織內(nèi)p-p38MAPK蛋白表達水平和海馬神經(jīng)元凋亡率。

總之，根據(jù)上述的實驗研究結(jié)果，我們推測α-LA對癲癇大鼠的海馬神經(jīng)元具有保護作用，可能與其下調(diào)p-p38MAPK蛋白的活性有關(guān)。

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