崔群力， 李巖琦

既往對(duì)帕金森病的研究多是從多巴胺能神經(jīng)元的角度來(lái)探索PD的發(fā)病機(jī)制，自從在PD患者腦和動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)致密部除了有大量DA能神經(jīng)元缺失外，還有膠質(zhì)細(xì)胞的大量增生［1］，免疫炎癥反應(yīng)在PD發(fā)病中的作用被日益受到重視［2］。炎癥反應(yīng)在腦中的標(biāo)志是腦中的固有細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞的激活［3］。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活和炎癥反應(yīng)過(guò)程可能代表了在PD中減少神經(jīng)元變性的一個(gè)治療方向。

姜黃素是食用香料姜黃的主要成分，具有抗氧化［4］、抗炎作用，能夠調(diào)節(jié)和抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)和遷移［5］。為此，我們采用神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)過(guò)的PC12細(xì)胞作為細(xì)胞模型，以魚(yú)藤酮作用于BV-2細(xì)胞后，以含有炎性細(xì)胞因子的條件培養(yǎng)液處理PC12細(xì)胞，觀察PC12細(xì)胞的存活率及凋亡現(xiàn)象，探討小膠質(zhì)細(xì)胞激活后對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的影響，研究姜黃素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活及保護(hù)多巴胺能細(xì)胞的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑 姜黃素、魚(yú)藤酮購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。姜黃素于DMSO中配成20 mmol/L儲(chǔ)液，-20℃儲(chǔ)存，用時(shí)以完全培養(yǎng)基稀釋成工作液;魚(yú)藤酮于DMSO中配成1 mmol/L儲(chǔ)液，-20℃儲(chǔ)存，用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋成工作液。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清。在通有5%CO2的37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液一次。細(xì)胞豐度達(dá)70% ～80%時(shí)傳代一次，并于細(xì)胞豐度達(dá)70% ～80%時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)前更換含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。BV-2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液一次，細(xì)胞豐度達(dá)70%～80%時(shí)傳代一次，并于試驗(yàn)前更換培養(yǎng)基。

1.2.2 條件培養(yǎng)液處理PC12細(xì)胞 姜黃素預(yù)處理BV-2細(xì)胞4 h加入所需終濃度的魚(yú)藤酮共孵育6 h，收集培養(yǎng)上清，作為PC12細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(microglia conditioned medium with curcumin，MCMC)。實(shí)驗(yàn)前更換PC12細(xì)胞的培養(yǎng)基，將條件培養(yǎng)液加入PC12細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)后的24 h觀察細(xì)胞存活率及凋亡。

1.2.3 分組和藥物處理 取魚(yú)藤酮和姜黃素母液，按適當(dāng)比例用完全培養(yǎng)基稀釋成工作液，DMSO的含量小于0.1%。魚(yú)藤酮組藥物終濃度分別為:5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、0.5 μmol/L 和1.0 μmol/L，孵育時(shí)間為 24 h。姜黃素藥物終濃度分別為 0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L。姜黃素預(yù)處理4 h后按要求加魚(yú)藤酮至所需終濃度(部分檢測(cè)指標(biāo)只涉及姜黃素 0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L;魚(yú)藤酮10 nmol/L)。另設(shè)姜黃素組(只加姜黃素)及無(wú)藥物處理組。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞活力將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞離心、收集，將細(xì)胞沉淀重懸于培養(yǎng)基中，將成團(tuán)細(xì)胞反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整至適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度1×108-9/L，按1×104-5個(gè)細(xì)胞/孔接種(每孔加細(xì)胞懸液90μl)于96孔培養(yǎng)板，每組6個(gè)復(fù)孔。另設(shè)調(diào)零孔不接種細(xì)胞，只加培養(yǎng)基，其他條件相同。姜黃素藥物終濃度分別為0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L;魚(yú)藤酮組分別加入適量的魚(yú)藤酮稀釋液(每孔10μl)，使其終濃度分別為 5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L 和 10 μmol/L;姜黃素預(yù)處組姜黃素藥物終濃度分別為0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，4 h 后按要求加魚(yú)藤酮至所需終濃度(10 nmol/L)共孵育6 h，對(duì)照組不加任何藥物(每孔終體積100μl)。孵育24 h后每孔加入10μl MTT(5 mg/ml)，37℃繼續(xù)孵育4 h，加入100μl DMSO，振蕩10 min至甲月贊顆粒充分溶解，在570 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD值。

1.3.2 蘇木素、伊紅染色觀察BV-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 將消毒好的多聚賴(lài)氨酸包被的蓋玻片置于六孔板中，然后接種適當(dāng)濃度的BV-2細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，加入姜黃素使其終濃度為0.5μmol/L、1 μmol/L、5μmol/L，預(yù)處理4 h后，加入魚(yú)藤酮至終濃度為10 nmol/L，同時(shí)設(shè)魚(yú)藤酮組和空白對(duì)照組，置37℃5%、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;棄去培養(yǎng)液，取出蓋玻片，自來(lái)水沖洗。4%多聚甲醛固定30 min;蘇木素染色10 min，自來(lái)水沖洗多余染液，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘，自來(lái)水沖洗;1%氨水(Scotte氏液)中返藍(lán)數(shù)秒鐘，自來(lái)水沖洗;1%伊紅乙醇染色3 min，自來(lái)水沖洗;自然風(fēng)干后，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察攝像。

1.3.3 DCGH-DA染色法檢測(cè)BV-2細(xì)胞內(nèi)活性氧類(lèi)物質(zhì)(ROS)水平 DCFH-DA(2’-7’-二氯熒光乙酰乙酸鹽)是一種能自由通過(guò)細(xì)胞膜的染色劑，其本身不發(fā)出熒光，當(dāng)被細(xì)胞內(nèi)ROS氧化為熒光化合物DCF時(shí)便發(fā)出熒光。通過(guò)檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度，反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。分組及藥物處理:姜黃素預(yù)處理組(0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)4 組;魚(yú)藤酮組;空白對(duì)照組，共6組。按要求加入姜黃素使其終濃度為0.5μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，預(yù)處理 4 h 后，加入魚(yú)藤酮終濃度為10 nmol/L，空白對(duì)照組不加任何藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃ 5%、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液體并收集細(xì)胞。進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè):波長(zhǎng)488 nm氬離子激光，觀察50000個(gè)以上細(xì)胞，波峰右移表明活性氧(ROS)含量高。

1.3.4 annexin V-FITC/PI雙染法，流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡。

1.3.4.1 檢測(cè)原理 磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)正常情況下位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。annexin V與PS有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的PS與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。碘化丙啶(propidine iodide，PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此，用annexinV與PI雙染色，可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。

1.3.4.2 操作步驟

1.3.4.2.1 分組及藥物處理 姜黃素預(yù)處理組(0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)4組;魚(yú)藤酮組;空白對(duì)照組，共6組。按要求于BV-2細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入姜黃素使其終濃度為0.5μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，預(yù)處理 4 h 后，加入魚(yú)藤酮至終濃度為10 nmol/L，空白對(duì)照組不加任何藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃ 5%、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h;然后搜集培養(yǎng)液作為PC12細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(MCMC)，將條件培養(yǎng)液加入到相應(yīng)組PC12細(xì)胞培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.4.2.2 各組細(xì)胞按要求處理后 離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，收集約1×105個(gè)細(xì)胞。加入500μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞;加入5μl annexin V-FITC混勻后，加入 5μl PI，混勻;室溫、避光、反應(yīng)5～15 min;1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng):488 nm;發(fā)射波長(zhǎng):530 nm)。

1.3.4.2.3 結(jié)果判斷 在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為(annexin V-/PI-);右下象限為早期凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)(annexin V+/PI-);右上象限是晚期凋亡細(xì)胞，為(annexin V+/PI+);而左上象限顯示壞死細(xì)胞，為(annexin V-/PI+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 檢測(cè)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，全部數(shù)據(jù)由SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組數(shù)據(jù)間的顯著性分析采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)間的顯著性分析采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 條件培養(yǎng)液對(duì)PC12細(xì)胞增殖活力的影響:姜黃素在低濃度(0.5 μmol/L～10μmol/L)時(shí)對(duì) PC12細(xì)胞及BV-2細(xì)胞活力無(wú)明顯影響;魚(yú)藤酮(10 nmol/L)對(duì)PC12細(xì)胞及BV-2細(xì)胞活力無(wú)明顯影響(資料未提供)。所以，我們選用姜黃素濃度(0.5μmol/L～10μmol/L)和魚(yú)藤酮(10 nmol/L)進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組、魚(yú)藤酮(10 nmol/L)組、姜黃素預(yù)處理組(姜黃素藥物終濃度分別為 0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，預(yù)處理4 h后，與終濃度10 nmol/L的魚(yú)藤酮共孵育BV-2細(xì)胞6 h，收集培養(yǎng)液作為PC12細(xì)胞的條件培養(yǎng)液)共6組。結(jié)果顯示:魚(yú)藤酮組與對(duì)照組比較，PC12細(xì)胞活力顯著降低(P＜0.01);姜黃素預(yù)處理的條件培養(yǎng)液使PC12細(xì)胞活力增加，與魚(yú)藤酮組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

2.2 姜黃素對(duì)魚(yú)藤酮致敏BV-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的影響 空白對(duì)照組:BV-2細(xì)胞突起明顯，成雙極狀;魚(yú)藤酮組:BV-2細(xì)胞激活，大多呈阿米巴樣;各姜黃素干預(yù)組:BV-2細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，以1.0μmol/L姜黃素干預(yù)組細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)最明顯。

2.3 DCGH-DA染色法檢測(cè)BV-2細(xì)胞內(nèi)活性氧類(lèi)物質(zhì)(ROS)水平 以DCFH-DA熒光強(qiáng)度反映ROS水平，空白對(duì)照組細(xì)胞的ROS水平為100±9.39%。應(yīng)用魚(yú)藤酮10 nmol/L處理24 h后，可使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，熒光強(qiáng)度增加，細(xì)胞ROS水平升至對(duì)照組的187.9±20.5%，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。分別給予0.5μmol/L、1.0 μmol/L、5.0 μmol/L、10 μmol/L 姜黃素預(yù)處理4 h后和10 nmol/L魚(yú)藤酮共同孵育24 h，可拮抗ROS的生成，熒光強(qiáng)度明顯降低，其中1.0μmol/L和5.0μmol/L姜黃素的抑制作用最強(qiáng)。上述各濃度姜黃素預(yù)處理組的細(xì)胞ROS水平分別為空白對(duì)照組的 167.9 ± 18.5%、142.9 ± 15.1%、137.1 ±17.6%和151.0±16.8%。0.5 μmol/L 姜黃素組與魚(yú)藤酮組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);1.0 μmol/L、5.0 μmol/L、10 μmol/L 姜黃素組與魚(yú)藤酮組比較差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.4 annexin V-FITC/PI雙染法，流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡 對(duì)照組、魚(yú)藤酮(10 nmol/L)、姜黃素預(yù)處理組(姜黃素藥物終濃度分別為0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，預(yù)處理4 h后，與魚(yú)藤酮終濃度10 nmol/L共孵育BV-細(xì)胞6 h)共6組。收集以上各組培養(yǎng)液作為PC12細(xì)胞的條件培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

流式圖顯示:空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為3.6±1.4%;魚(yú)藤酮處理組，細(xì)胞凋亡率升至41.3±5.1%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L各姜黃素條件培養(yǎng)液組PC12細(xì)胞凋亡率分別為:34.6 ± 2.8%、21.6 ± 3.0%、26.7 ± 4.1%、32.8 ±1.9%，與魚(yú)藤酮組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

3 討論

PD是一種神經(jīng)變性疾病，以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失為特征，并且多巴胺能神經(jīng)元的丟失在PD癥狀出現(xiàn)前多年就已經(jīng)開(kāi)始。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)是神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病共有的重要特征［6］。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是關(guān)鍵的因素。

小膠質(zhì)細(xì)胞是腦中的固有細(xì)胞，在海馬、基底節(jié)和中腦小膠質(zhì)細(xì)胞密度最高［7］，在中腦這個(gè)區(qū)域也是PD多巴胺能神經(jīng)元受損最嚴(yán)重的區(qū)域。研究證明:小膠質(zhì)細(xì)胞受到某些因素的刺激激活介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)增加了外源性刺激或毒素對(duì)神經(jīng)元的破壞。小膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)控制的激活導(dǎo)致了神經(jīng)變性疾病的慢性進(jìn)展，是PD進(jìn)行性發(fā)展的驅(qū)動(dòng)力［8］。在無(wú)小膠質(zhì)細(xì)胞存在時(shí)，MPTP誘導(dǎo)的急性神經(jīng)毒性是非進(jìn)展性的;而在小膠質(zhì)細(xì)胞存在時(shí)，MPTP誘導(dǎo)了很強(qiáng)的、進(jìn)展性的多巴胺能神經(jīng)元變性［9］。而且，藥物抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活或者敲除編碼各種炎癥介質(zhì)的基因可以抑制MPTP或LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性損害［10］。總之，過(guò)度的炎癥反應(yīng)，無(wú)論是作為起始因素還是繼發(fā)反應(yīng)都促發(fā)了神經(jīng)變性疾病慢性、進(jìn)展性的過(guò)程。

因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，阻斷炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的對(duì)神經(jīng)元損傷的惡性循環(huán)，從而預(yù)防或減緩神經(jīng)變性疾病的進(jìn)展，這可能代表了神經(jīng)變性疾病的一個(gè)治療方向。姜黃素是食用香料姜黃的主要成分，具有抗氧化、抗炎作用。最近的研究亦顯示:姜黃素能夠通過(guò)抗炎作用防護(hù)6-羥多巴胺、MPP﹢和MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)變性;能通過(guò)抑制NF-κB和AP-1同DNA的結(jié)合來(lái)抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞 COX-2基因表達(dá)［11］;能通過(guò) NF-κB 信號(hào)通路抑制促炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮抗炎作用［11］。為此，我們采用姜黃素預(yù)處理BV-2細(xì)胞的條件培養(yǎng)液來(lái)觀察魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)對(duì)PC12細(xì)胞的影響。

我們的研究結(jié)果顯示，0.5μmol/L～10μmol/L姜黃素條件培養(yǎng)液組與魚(yú)藤酮組比較PC12細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，1.0μmol/L和5.0μmol/L姜黃素組的條件培養(yǎng)液對(duì)PC12細(xì)胞活力影響最顯著(P＜0.01)。因?yàn)轸~(yú)藤酮是細(xì)胞線粒體復(fù)合物I抑制劑，能夠抑制線粒體對(duì)氧的利用，從而產(chǎn)生大量ROS。我們推測(cè)姜黃素可能通過(guò)直接清除BV-2細(xì)胞內(nèi)的ROS保護(hù)多巴胺細(xì)胞。于是，我們測(cè)定BV-2細(xì)胞內(nèi)的ROS結(jié)果顯示姜黃素明顯減少了魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞內(nèi)的ROS的含量，且以1.0μmol/L和5.0 μmol/L姜黃素作用最強(qiáng)(P ＜0.01)。我們分析:魚(yú)藤酮抑制BV-2細(xì)胞線粒體呼吸鏈對(duì)氧的利用，產(chǎn)生大量ROS;而B(niǎo)V-2細(xì)胞內(nèi)ROS的增多又可作為刺激因素促使BV-2細(xì)胞釋放其它炎癥介質(zhì)［12，13］;BV-2 細(xì)胞內(nèi) ROS 滲透到細(xì)胞外及其產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)造成PC12細(xì)胞的凋亡［14］。姜黃素通過(guò)清除BV-2細(xì)胞內(nèi) ROS，從而抑制BV-2細(xì)胞的激活，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，保護(hù)了多巴胺能細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，姜黃素通過(guò)減少小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，或直接清除細(xì)胞內(nèi)ROS，阻斷了小膠質(zhì)細(xì)胞激活的惡性循環(huán)，從而保護(hù)多巴胺能細(xì)胞。

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