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乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細胞在皮膚形態(tài)發(fā)生和內(nèi)穩(wěn)態(tài)中彼此獨特且互補的作用

真皮層是人類皮膚的重要組成部分，位于由多層角質(zhì)形成細胞組成的表皮與皮下組織之間。真皮與表皮通過基底膜帶(BMZ)既被相互分隔又有密切的聯(lián)系。目前研究認為，真皮可分為兩個不同的部分，分別為表淺部的乳頭層和深部的網(wǎng)狀層。這兩層的組成和結(jié)構(gòu)在細胞外基質(zhì)、細胞密度和存在的神經(jīng)及血管結(jié)構(gòu)等方面有明顯不同。Ⅲ型膠原主要存在于真皮乳頭層，而Ⅰ型膠原則二層均可見，Ⅰ型前膠原優(yōu)先產(chǎn)生于靠近表皮的乳頭層。核心蛋白聚糖和雙鏈蛋白聚糖(蛋白聚糖家族)也優(yōu)先表達于乳頭層，網(wǎng)狀層內(nèi)幾乎不表達。真皮結(jié)構(gòu)蛋白(如肌腱蛋白亞型)在真皮內(nèi)也具有明確的分布特點，肌腱蛋白C分布于乳頭層，肌腱蛋白X分布于網(wǎng)狀層。成纖維細胞是真皮主要的細胞類型。成纖維細胞產(chǎn)生ECM的成分并對其進行組織，且通過稱為整合素的膜受體與ECM相互作用。成纖維細胞還通過分泌分子和可溶性因子參與皮膚生理學(xué)功能的調(diào)節(jié)，如細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及其基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)。

近年來，已證實真皮成纖維細胞并非同一群細胞，至少可被分為兩種亞群。乳頭層成纖維細胞(papillary fibroblasts，F(xiàn)p)，聚集于真皮表淺部、表皮下方，由表皮真皮連接部(DEJ)將其與表皮隔開；網(wǎng)狀層纖維細胞(reticular fibroblasts，F(xiàn)r)位于其余真皮部分。有文獻報道，這兩種類型的真皮成纖維細胞在體外培養(yǎng)時特性不同，如細胞形態(tài)和增殖速率。研究還證實，F(xiàn)p的生物學(xué)特性會隨年齡增長而改變，老年人皮膚內(nèi)的Fp數(shù)量明顯減少。乳頭層成纖維細胞的密度高于網(wǎng)狀層內(nèi)的成纖維細胞，且其代謝活性更強。體外培養(yǎng)時，從真皮乳頭層和網(wǎng)狀層分離的成纖維細胞顯示出不同的特性。Fp比Fr的生長能力強；相比Fp的細胞形態(tài)，F(xiàn)r則更多表現(xiàn)為樹突狀和伸展?fàn)?。此外，F(xiàn)r比Fp的細胞匯合密度低，且接觸抑制敏感性較高。

在單層培養(yǎng)物中，兩種成纖維細胞亞群均能合成細胞外基質(zhì)大分子，但合成的種類和數(shù)量不同。例如，F(xiàn)r產(chǎn)生的Ⅰ型膠原和多功能蛋白聚糖多于Fp；而Fp產(chǎn)生的核心蛋白聚糖多于Fr。兩種細胞亞群產(chǎn)生的細胞因子和激素也均有不同。例如，F(xiàn)p合成的GM-CSF多于Fr；相反，F(xiàn)r產(chǎn)生的KGF多于Fp。總之，這些結(jié)果證實，培養(yǎng)的真皮乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細胞其特性有差異。然而，尚無研究顯示這兩種亞群對人皮膚形態(tài)發(fā)生(重建)的影響。該研究的目的是調(diào)查這兩種真皮成纖維細胞亞群在人體外重建皮膚(其結(jié)構(gòu)接近于在體皮膚)形態(tài)發(fā)生中所起的作用。為此，該研究使用了人體外重建皮膚3D模型，其真皮由Fp或Fr成纖維細胞填充。該研究顯示，皮膚真皮乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細胞的作用既有差異，又互為補充，提示二者對人皮膚的正常形態(tài)發(fā)生和內(nèi)穩(wěn)態(tài)都是必需的。

一、材料和方法

1.細胞培養(yǎng)：乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細胞來源于3名19～21歲的年輕白種人捐贈的乳房皮膚。使用皮刀分離真皮乳頭層和網(wǎng)狀層。將切片置于培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)分離伸展開的乳頭層或網(wǎng)狀層成纖維細胞。將乳頭層或網(wǎng)狀層成纖維細胞平鋪在150 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，密度為1×104細胞/cm2。成纖維細胞在添加了非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青霉素-鏈霉素(20 U/ml)和10%胎牛血清的MEM(minimum essential Eagle's medium)內(nèi)生長。培養(yǎng)物保存于37℃、95%濕度和5%CO2環(huán)境下。每周更新3次培養(yǎng)基，直至成纖維細胞培養(yǎng)進入亞匯合狀態(tài)。該研究的角質(zhì)形成細胞來源于1名30歲白種人捐贈的乳房皮膚。

2.人體外重建皮膚：使用包埋于牛Ⅰ型膠原凝膠內(nèi)的人真皮乳頭層或網(wǎng)狀層成纖維細胞(每個培養(yǎng)格1×106個成纖維細胞)制備真皮替代物(膠原成纖維細胞收縮格)。終體積為7 ml(含培養(yǎng)基)，包括2 ml的膠原(濃度為3.5 mg/ml)。培養(yǎng)格在37℃和5%CO2環(huán)境下可以收縮5 d。使用不銹鋼圈將人表皮角質(zhì)形成細胞種植在真皮替代物上，進行表皮重建。將培養(yǎng)物浸沒培養(yǎng)1周，然后提至氣液交界處的網(wǎng)格上1周，以產(chǎn)生分層和分化的表皮。使用添加10%胎牛血清、10 ng/ml表皮生長因子(EGF)、8.4 ng/ml霍亂毒素和0.4 μg/ml氫化可的松的MEM，培養(yǎng)基每周更新3次。

3.組織學(xué)處理：樣本被固定在中性甲醛內(nèi)，進行組織學(xué)處理。用蘇木精、伊紅、藏紅花(HES)染色石蠟切片。

4.免疫組織化學(xué)：樣本包埋在Tissue-Tek內(nèi)，切成5 μm的切片液氮凍存。小鼠單克隆抗體抗：人絲聚蛋白、角蛋白10、原纖蛋白1；大鼠單克隆抗體抗人Ⅰ型前膠原；兔多克隆抗體抗人Ⅲ型前膠原；兔多克隆抗血清抗人兜甲蛋白；小鼠單克隆上清液(蛋白聚糖抗體)抗人皮膚素和抗硫酸軟骨素鏈。異硫氰酸熒光素(FITC)結(jié)合的兔抗小鼠免疫球蛋白，或Alexa結(jié)合的山羊抗小鼠免疫球蛋白，或FITC結(jié)合的山羊抗大鼠免疫球蛋白，或FITC結(jié)合的豬抗兔免疫球蛋白被用作二抗。使用普羅匹定碘化物進行核染色。在熒光顯微鏡下觀察并成像染色的組織切片。

5.酶聯(lián)免疫吸附測定MMP1、MMP3、VEGF和KGF：使用ELISA試驗測定組織培養(yǎng)基內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP1)、間質(zhì)膠原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP3)、基質(zhì)降解酶、角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的含量。

6.酶譜分析：用NOVEX預(yù)制酶譜凝膠通過檢測蛋白水解活性來研究金屬蛋白酶。具體方法參見原文。

7.對樣本進行RT-PCR、逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR的分析：具體方法參見原文。

二、結(jié)果

1.人真皮的兩層結(jié)構(gòu)分別含有兩種不同的成纖維細胞亞群：人皮膚的外部為分層的表皮(E)，其下方相對較薄的一層真皮結(jié)構(gòu)對應(yīng)為真皮乳頭層(DP)，而較厚的深部層對應(yīng)為真皮網(wǎng)狀層(DR)。組織學(xué)研究顯示，角質(zhì)層由表皮內(nèi)角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生，并證實真皮乳頭層與網(wǎng)狀層的基質(zhì)結(jié)構(gòu)有顯著差異。

2.體外培養(yǎng)的乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細胞的增殖速率和膠原收縮：比較短期培養(yǎng)物中Fp和Fr各自的生長率。Fp的生長率明顯高于Fr。在培養(yǎng)結(jié)束時(23d)，F(xiàn)p的數(shù)量是Fr的兩倍。單層培養(yǎng)物組織學(xué)結(jié)果顯示，二者細胞形態(tài)有差異。4 d后評估Fp和Fr的膠原凝膠收縮能力。凝膠的收縮在Fr存在時更為明顯，尤其是在初始收縮期(第1個24 h)。

3.真皮乳頭層成纖維細胞的存在促進表皮的最佳分化：表皮分化的連續(xù)性形態(tài)學(xué)變化與角質(zhì)形成細胞的主要基因產(chǎn)物的表達有關(guān)，如角蛋白和中間絲相關(guān)蛋白等。角質(zhì)形成細胞分化的4個階段與表皮各層相對應(yīng)：基底層、棘細胞層、顆粒層和角質(zhì)層。角蛋白10的免疫組織學(xué)染色證實了兩種成纖維細胞亞群均能維持表皮的形態(tài)發(fā)生。角蛋白是角質(zhì)形成細胞分化標(biāo)記物之一，在Fp和Fr存在時大量表達。比較用Fp或Fr構(gòu)建的人體外重建皮膚的組織學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)兩個皮膚模型的表皮層存在著明顯差異。Fp存在時，表皮分層和分化表現(xiàn)最佳；反之，F(xiàn)r存在時，表皮結(jié)構(gòu)化程度較低，顆粒層缺乏。中間絲蛋白和兜甲蛋白的免疫染色可證明顆粒層的分化水平，兩種標(biāo)記物在Fp存在的條件下均可大量表達，而Fr存在時表達較低。RT PCR的定量分析也在mRNA水平上證實了這些結(jié)果。結(jié)果清楚地顯示，F(xiàn)p細胞具有較高的促終末角質(zhì)形成細胞分化能力，能夠在體外重建皮膚模型內(nèi)促進結(jié)構(gòu)良好的表皮形態(tài)發(fā)生。

4.真皮網(wǎng)狀層成纖維細胞的存在有效促進細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生：在真皮內(nèi)，由真皮成纖維細胞產(chǎn)生和組織的細胞外基質(zhì)分子非常重要。真皮細胞外基質(zhì)蛋白和DEJ成分在含有Fr的體外重建皮膚模型內(nèi)含量較高。Fr存在時，真皮的成熟和真表皮連接部基底膜更明顯。免疫組織化學(xué)和mRNA結(jié)果證實，在含有Fr的體外重建皮膚模型中，Ⅰ型和Ⅲ型前膠原及糖胺聚糖鏈的沉積明顯較高。這些結(jié)果證實，在體外重建皮膚模型中，相比Fp，網(wǎng)狀層成纖維細胞有效參與主要細胞外基質(zhì)分子如Ⅰ型和Ⅲ型膠原、蛋白聚糖(PG4)和原纖蛋白1的生成。

5.乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細胞釋放MMPs和生長因子的相對特異性：如MMPs、細胞因子和生長因子等在細胞外環(huán)境中的釋放能夠維持皮膚的正常生理功能。使用ELISA或酶譜法分析分別由Fp和Fr構(gòu)建的體外重建皮膚模型培養(yǎng)基內(nèi)的可溶性因子。MMPs對真皮基質(zhì)的降解起重要作用，并與其重構(gòu)有關(guān)。Fp能夠上調(diào)MMP1，而Fr能刺激MMP3的產(chǎn)生。含有Fp的重建皮膚培養(yǎng)基中的MMP1水平(mRNA和蛋白)是含F(xiàn)r的2至3倍。MMP3的結(jié)果則完全相反。與Fp相比，F(xiàn)r存在時 MMP2活性(酶譜分析)和mRNA MMP2表達水平較高。

分別檢測含有Fp和Fr的體外重建皮膚培養(yǎng)基中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)。結(jié)果顯示，含有Fp時，VEGF量是含有Fr的兩倍。與此相反，與Fp相比，含有Fr時KGF呈雙倍增長。

三、討論

體外重建皮膚模型的使用可以更加詳細地研究成纖維細胞在皮膚形態(tài)發(fā)生中的作用，因為此模型能夠介導(dǎo)真皮成分中的既定成纖維細胞亞群而構(gòu)成。該研究比較了乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細胞制備的兩種體外重建皮膚模型。使用新鮮分離的Fr和Fp，首次證實了乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細胞在生長速率和膠原格收縮能力方面存在的差異，這是一個重要的先決條件。使用體外重建皮膚模型，將這些細胞類型放置在接近在體真實皮膚的3D環(huán)境中并加以比較，可以對其差異進行更進一步地研究。

研究結(jié)果顯示，乳頭層成纖維細胞，通過與表皮角質(zhì)形成細胞相互“交流”，極好地促進了表皮的分層和終末分化，這或許如實地反映了在體相互作用的過程。該研究還顯示，F(xiàn)p具有較高的VEGF生成刺激能力，但是缺乏預(yù)期的產(chǎn)生真皮和DEJ的主要細胞外基質(zhì)分子成分的功能，可能與網(wǎng)狀層成纖維細胞的缺乏以及作為輔助因子對乳頭層成纖維細胞的潛在影響相關(guān)。雖然Fp緊挨著表皮的DEJ，但該研究結(jié)果顯示，在現(xiàn)有的體外重建皮膚模型實驗條件下，與Fr的相互作用似乎是DEJ形成所必不可少的條件。

該研究還顯示，在體內(nèi)環(huán)境中活性較弱的網(wǎng)狀層成纖維細胞在真皮細胞外基質(zhì)成分及DEJ細胞外基質(zhì)分子的生成上具有意想不到的活性。這或許是因為將其置于乳頭層環(huán)境中，與表皮角質(zhì)形成細胞的異常接近所致。網(wǎng)狀層成纖維細胞對表皮角質(zhì)形成細胞的影響也可以通過創(chuàng)傷愈合過程中特征性KGF的釋放加以說明，很可能是所觀察到的表皮終末分化受到輕微抑制的原因。KGF可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞的增殖，但會抑制其終末分化能力。KGF在Fr存在時高表達，可以解釋在用Fr構(gòu)建的模型中所發(fā)現(xiàn)的角質(zhì)形成細胞分化延遲和基底層角質(zhì)形成細胞數(shù)量相對增加的觀察結(jié)果。Fp與Fr的功能性差異對人皮膚老化也具有重要意義，特別是真皮Fp亞群隨年齡的增長而逐漸消失。這種可能性很重要，因為乳頭層成纖維細胞被網(wǎng)狀層成纖維細胞所替代可以導(dǎo)致KGF增加，進而造成表皮分層和分化的損傷。

總之，該研究結(jié)果證實，乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細胞具有獨特且互補的作用。為了檢驗體外皮膚全層模型，今后的研究需進一步發(fā)展至使用乳頭層成纖維細胞和網(wǎng)狀層成纖維細胞兩種亞細胞群組成的真皮替代物來重建皮膚模型，使得體外重建皮膚更接近在體皮膚細胞網(wǎng)絡(luò)。

[陳旭 孔佩慧 甄雅賢 摘自 Eur J Dermatol，2012，22(3):324-332.]