馬云帆 范夢穎 陳克能

肺癌已成為全世界范圍內(nèi)的一個(gè)重大公共衛(wèi)生問題，在中國，雖然肺癌已是死亡率與發(fā)病率最高的惡性腫瘤，但其發(fā)病率仍未達(dá)到最高峰[1]。隨著肺癌治療手段的改變，近年來療效有所改善，然而其預(yù)后普遍較差，5年生存率約為15%。非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）占全部肺癌的80%以上，其中大多數(shù)組織學(xué)類型為腺癌（adenocarcinoma, ADC）（40%-50%）和鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma,SQCC）（30%）。NSCLC的治療原則長期依據(jù)以解剖學(xué)為基礎(chǔ)的TNM分期。隨著對肺癌基因背景的認(rèn)識(shí)，更多的理論加入了肺癌治療選擇的依據(jù)，例如：抗葉酸化療藥物“培美曲塞”只對肺ADC有效[2]，貝伐單抗則應(yīng)歸避用于肺SQCC[2]，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine-kinase inhibitor,EGFR-TKI）治療只對有EGFR基因突變者有效[3]，克唑替尼只對ALK基因重排的人群有效[4]。因此，肺癌的治療策略已經(jīng)從傳統(tǒng)的以分期為基礎(chǔ)的治療模式轉(zhuǎn)變?yōu)橐越M織學(xué)類型和基因突變?yōu)橹笇?dǎo)的個(gè)體化、精準(zhǔn)的多學(xué)科治療模式。隨著NSCLC的研究進(jìn)展，更多地依據(jù)臨床、影像、病理生長類型、基因表達(dá)和分子生物學(xué)標(biāo)志物等特征將NSCLC分成預(yù)后不同的多種亞型，從而指導(dǎo)臨床治療決策。

鏡下形態(tài)特征一直是WHO肺癌分類的金標(biāo)準(zhǔn)。一般來講，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）染色已足夠區(qū)別肺ADC與非ADC。但在少數(shù)情況下，如穿刺獲得的小標(biāo)本，甚至細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，難以了解腫瘤全貌，III期、IV期NSCLC患者由于不能手術(shù)切除腫瘤，小標(biāo)本往往又是診斷唯一可利用的組織?；虍?dāng)腫瘤分化較差時(shí)，缺少肺ADC和SQCC的細(xì)胞學(xué)結(jié)構(gòu)特征，分型就比較困難。因此出現(xiàn)了組織學(xué)類型不明確型非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung carcinoma-not otherwise specified, NSCLC-NOS）的概念[5]。2009年的一項(xiàng)研究[6]表明在活檢標(biāo)本中NSCLC-NOS的比例約為25%，而在細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中其比例達(dá)到40%。由于肺癌精確分型的需要，過去病理學(xué)單純依靠形態(tài)學(xué)進(jìn)行診斷的方式已受到了挑戰(zhàn)。基于以上這些情況，免疫組化（immunohistochemistry, IHC）檢測在NSCLC的亞分型中就顯得十分重要。IHC因其簡便、相對廉價(jià)和可靠的特點(diǎn)，已經(jīng)得到了廣泛的公認(rèn)。IHC不僅可以對各種低分化肺癌進(jìn)行分型，更適合于取材受限的小標(biāo)本。2011年國際肺癌研究協(xié)會(huì)、美國胸科學(xué)會(huì)及歐洲呼吸學(xué)會(huì)（IASLC/ATS/ERS）公布了肺ADC的多學(xué)科分類原則，指出肺癌的亞分型不能單純依靠傳統(tǒng)的HE染色切片，特別是在診斷小標(biāo)本和細(xì)胞學(xué)組織時(shí)，還需要IHC的指導(dǎo)[5]。雖然最佳的診斷標(biāo)準(zhǔn)還沒有確立，但研究[7]已表明IHC提高了診斷的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，減少了NSCLC小標(biāo)本不能被亞分型的幾率。

常用的鑒別SQCC指標(biāo)為p63、p40和細(xì)胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6, CK5/6）。常用的鑒別ADC指標(biāo)為甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyroid transcription factor -1, TTF-1）、新天冬氨酸蛋白酶 A（novel aspartic proteinase A, Napsin A）和細(xì)胞角蛋白7（cytokeratin 7, CK7）。本文就常用的IHC標(biāo)志物的診斷意義及預(yù)后意義作一綜述。

1 肺鱗癌IHC標(biāo)志物的診斷及預(yù)后意義

1.1 肺鱗癌IHC標(biāo)志物的診斷價(jià)值

1.1.1 p63、p40在診斷肺SQCC中的應(yīng)用 p63基因位于染色體3q27-29，與p53有結(jié)構(gòu)同源性。p63有兩個(gè)啟動(dòng)子，通過可變剪接產(chǎn)生兩個(gè)相對的類蛋白：全長蛋白TAp63(含有反式激活域）和截短蛋白ΔNp63（缺乏反式激活域），即p40。TAp63有與p53類似的反式激活TA結(jié)構(gòu)域，調(diào)控生長抑制基因的表達(dá)。ΔNp63同種型包含有一種替代轉(zhuǎn)錄惰性的“ΔN”域，拮抗TAp63和p53的活性。所以p63包含2個(gè)功能相反的亞型：TAp63-類p53腫瘤抑癌基因和ΔNp63-致癌基因。4A4抗體既識(shí)別TAp63，又可以識(shí)別ΔNp63，而p40抗體只識(shí)別ΔNp63。p63和p40均在細(xì)胞核染色。

研究[8]已經(jīng)表明p63蛋白診斷肺SQCC的靈敏度接近100%。同時(shí)，p63在SQCC中穩(wěn)定的表達(dá)陽性，與分化程度無關(guān)，是一個(gè)高度穩(wěn)定的標(biāo)志物[9]。p63的應(yīng)用主要限制是它的特異性低，為60%-86%[10]。p63的在ADC中的陽性率約16%-65%[11]。在大多數(shù)的p63陽性的ADC中，表達(dá)是局灶的，但在個(gè)別病例接近典型的SQCC程度[12]，往往可能是ADC的實(shí)性變異。p63蛋白作為“鱗狀標(biāo)記物”的另一個(gè)重要限制是它可以表達(dá)在多種其它類型的腫瘤，特別是淋巴瘤，已報(bào)道其陽性反應(yīng)達(dá)50%[13]。這可能造成誤診誤治，因?yàn)榇蠹?xì)胞淋巴瘤可表現(xiàn)為孤立性胸腔腫塊，其上皮的形態(tài)也可以類似NSCLC。在這種情況下，p63表達(dá)強(qiáng)陽性可能將淋巴瘤誤診為SQCC。但總體來說，p63還是一個(gè)非常靈敏、特異的反映鱗狀分化的標(biāo)志物。

雖然ΔNp63（p40）和TAp63剪接變體都在NSCLC表達(dá)，但ΔNp63是更主要的異構(gòu)體，它選擇性地表達(dá)在SQCC中。2000年Hibi等[14]采用IHC第一個(gè)研究了p40抗體，根據(jù)23例肺癌分析發(fā)現(xiàn)p40對SQCC是完全的敏感和特異的，當(dāng)時(shí)這一發(fā)現(xiàn)未被重視。直到Pelosi等[15]研究了20例肺SQCC全組織切片，隨后又增加了46例小標(biāo)本和細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，及手術(shù)切除的NSCLC標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)p40抗體不像p63的4A4抗體，對SQCC有100%的特異性。另一項(xiàng)研究[16]中，總共對150例肺ADC和50例肺SQCC采用p63（4A4）和ΔNp63（p40）進(jìn)行免疫染色，所有SQCC中p63和p40均彌漫陽性，ADC中27例（18%）p63呈陽性反應(yīng)，而p40均陰性。p40檢測SQCC的敏感性相當(dāng)于p63，但特異性卻高于p63。

1.1.2 CK5/6在診斷肺SQCC中的應(yīng)用 CK是由分子量和等電點(diǎn)不同的20個(gè)多肽構(gòu)成的一個(gè)大家族，CK分為兩種類型，1型（CK9-20）是較小酸性多肽、2型（CK1-8）是較大的中性多肽。CK是一種中間絲蛋白，中間絲（7-11納米）是真核細(xì)胞中主要的細(xì)胞骨架蛋白。CK家族都表達(dá)于上皮細(xì)胞，是反應(yīng)上皮細(xì)胞分化有用的標(biāo)志物。CK在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色。CK在維持正常上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。研究[17]認(rèn)為CK結(jié)構(gòu)重排觸發(fā)了染色質(zhì)的重組，并提供了具有生長活性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在致癌機(jī)制中發(fā)揮直接作用。研究表明，CK的表達(dá)增加可能反映了腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。

CK5/6屬于中等大小的堿性角蛋白。在正常組織中，CK5/6主要表達(dá)于角化（上皮）和非角化（粘膜）的鱗狀上皮，以及前列腺、乳腺和唾液腺的基底肌上皮細(xì)胞層。CK5/6也出現(xiàn)在上皮、粘膜鱗狀上皮和肌上皮起源的良性和惡性腫瘤，如乳腺癌的基底層和間皮瘤。CK5/6是敏感的反映鱗狀分化的標(biāo)志物，報(bào)道中其診斷肺SQCC的敏感度為75%-100%[18]，特異性在Whithaus等[10]的研究中也達(dá)到96%。CK5/6在原發(fā)性肺ADC中表達(dá)陽性的比例很?。?%-8%）[18,19]。

除了p63、p40和CK5/6外，還有許多其它的鱗狀上皮標(biāo)記物，包括34bE12、Desmocollin-3、S100A2、S100A7、SOX2、Glypican 3、miR-205，已經(jīng)應(yīng)用于從ADC中鑒別肺SQCC。這些標(biāo)記物沒有能與p40相匹配的靈敏性和特異性。唯一特異性接近100%的是Desmocollin-3，然而有報(bào)道其敏感性從52%-100%不等[11]。

1.2 肺鱗癌IHC標(biāo)志物的預(yù)后價(jià)值 目前p63蛋白表達(dá)對NSCLC的預(yù)后的影響已有報(bào)道，但結(jié)果相互矛盾[20,21]。在Renouf[21]和Au[22]的研究中，單因素分析p63高表達(dá)是患者良好預(yù)后的指標(biāo)，但多因素分析沒有意義。雖然目前p63在預(yù)測患者預(yù)后方面并沒有明顯的優(yōu)勢，但NSCLC患者p63基因3q擴(kuò)增和p63過表達(dá)可以延長生存[23]。Ko等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，在淋巴結(jié)陰性的I期-II期NSCLC患者中，RASSF1A甲基化和p63蛋白陰性表達(dá)可能與差的RFS相關(guān)聯(lián)，而且這種關(guān)聯(lián)與組織學(xué)類型無關(guān)。而Iwata等[20]研究發(fā)現(xiàn)p40表達(dá)強(qiáng)度不影響患者的遠(yuǎn)期生存。

p63、p40影響患者生存的可能機(jī)制為：基因組的異常特別是染色體區(qū)域3q26-3qter的擴(kuò)增，是肺癌癌變的主要特征。令人感興趣的是p63基因測序譜就是在3q27-29擴(kuò)增[25]。最近有研究[26]顯示p63和突變型p53在轉(zhuǎn)錄激活、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、腫瘤形成、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中相互拮抗。除了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)，p63的缺失也是與各種癌癥的侵襲密切相關(guān)的因素[27]。ΔNp63的一個(gè)復(fù)雜結(jié)構(gòu)在COOH端，剪接產(chǎn)生外顯子導(dǎo)致5種不同的C-末端（α、β、γ、δ和ε）。在特定條件下，ΔNp63α可以通過p53和TA同種型誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡被下調(diào)[28]。

查閱文獻(xiàn)，未見有關(guān)于CK5/6表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)的報(bào)道。但有研究[29]發(fā)現(xiàn)CK5/6聯(lián)合其它標(biāo)志物可以預(yù)測基底樣乳腺癌患者的生存。

2 肺腺癌IHC標(biāo)志物的診斷及預(yù)后意義

2.1 肺腺癌IHC標(biāo)志物的診斷價(jià)值

2.1.1 TTF-1在診斷肺ADC中的應(yīng)用 TTF-1基因位于染色體14q13，表達(dá)產(chǎn)物為38 kDa的核蛋白，位于細(xì)胞核，屬于Nkx2同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族成員。TTF-1特異表達(dá)在肺和甲狀腺腫瘤。TTF-1蛋白的表達(dá)簡單，可以直接評估。它完全局限于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，而非細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上，不存在反應(yīng)性非腫瘤基質(zhì)細(xì)胞或炎癥細(xì)胞浸潤。TTF-1可能是目前最好的鑒別肺ADC的標(biāo)志物，也用于區(qū)分肺原發(fā)性ADC和來自于甲狀腺以外的轉(zhuǎn)移性肺ADC。肺ADC中，TTF-1表達(dá)在75%-85%[30]。文獻(xiàn)[31]報(bào)道TTF-1診斷肺ADC的敏感性為60%-89%，特異性為75%-98%。而肺SQCC中TTF-1通常表達(dá)陰性，但也有少量的陽性表達(dá)的報(bào)道，陽性比例在1%-37%之間[32]。

2.1.2 Napsin A在診斷肺ADC中的應(yīng)用 Napsin A基因位于染色體19q13.3上，編碼的產(chǎn)物為45 kDa含有420個(gè)氨基酸的單鏈蛋白，其表達(dá)受TTF-1調(diào)控。Napsin A特異表達(dá)于肺和腎臟，在肺內(nèi)表達(dá)于肺泡II型細(xì)胞。Napsin A的IHC染色位于細(xì)胞漿。2000年，Hirano等[33]首先發(fā)現(xiàn)了該標(biāo)志物主要在肺ADC中的表達(dá)。不同的研究中Napsin A在肺ADC中陽性表達(dá)的比例約58%-91%[34]，需要指出的是低陽性表達(dá)率的研究中使用的是組織芯片、活檢或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本。文獻(xiàn)[31]報(bào)道Napsin A鑒別肺ADC的敏感性為83%-90%、特異性為90%-98%，比TTF-1更準(zhǔn)確。Napsin A已成為新的肺ADC標(biāo)志物。研究[35]發(fā)現(xiàn)與TTF-1相比，Napsin A表現(xiàn)出更強(qiáng)和彌漫的染色。因此在TTF-1弱染色、局灶性染色或結(jié)果難以解釋的情況下，Napsin A檢測特別有用。在幾項(xiàng)比較Napsin A和TTF-1表達(dá)的研究中，其中一些認(rèn)為在ADC中Napsin A是一個(gè)比TTF-1更敏感的指標(biāo)[36]，但也有相反的結(jié)論[37]。大多數(shù)研究[7]表明Napsin A在肺SQCC中不表達(dá)，但也有文獻(xiàn)[32]報(bào)道，Napsin A在SQCC中陽性表達(dá)率為12.5%-26%。

2.1.3 CK7在診斷肺ADC中的應(yīng)用 CK7高度表達(dá)在氣管和尿路上皮細(xì)胞。有報(bào)道[38]認(rèn)為CK7鑒別肺ADC具有高度敏感性（94%-100%），但特異度不高（53%-78%）。CK7可以幫助識(shí)別TTF1和粘蛋白（mucin）染色陰性的肺ADC。CK-7在肺SQCC中也有陽性表達(dá)（30%-60%），特別是在周圍型SQCC[36]。

Mucin也是一個(gè)鑒別ADC的IHC指標(biāo)，但它的敏感性較低（23%-30%）[39]。近年來，表面活性蛋白-A （surfactant apoprotein-A, SP-A）和TTF-1，都被確認(rèn)為是有價(jià)值的診斷肺ADC的外周氣道上皮細(xì)胞標(biāo)志物。盡管SP-A對肺ADC具有高度特異性，但與TTF-1相比，靈敏度較低。它的缺點(diǎn)是表達(dá)直接與組織學(xué)亞型和分化程度有關(guān)[40]。雖然高分化ADC通常強(qiáng)烈表達(dá)SP-A，但在診斷最困難的低分化腫瘤中通常不表達(dá)。

2.2 肺腺癌IHC標(biāo)志物的預(yù)后價(jià)值 TTF-1是診斷型肺癌標(biāo)志物中最早被關(guān)注的與生存相關(guān)的標(biāo)志物。但自1999年P(guān)uglisi等[41]首次提出TTF-1與肺癌患者生存有關(guān)后，不斷受到質(zhì)疑。Pelosi等[42]研究發(fā)現(xiàn)，雖然TTF-1的表達(dá)與生存不相關(guān)，但有超過75%免疫反應(yīng)細(xì)胞的患者預(yù)后更好。在Berghmans等[19]的meta分析中，有4項(xiàng)研究表明 TTF-1陽性和更好的生存有關(guān)，5項(xiàng)研究的結(jié)果顯示TTF-1陽性對生存沒有明顯影響，甚至有一項(xiàng)研究認(rèn)為TTF-1陽性是生存不良的預(yù)后因素。這些異質(zhì)性的結(jié)果可能是由于以下原因造成：不同的TTF-1陽性評分閾值、使用單克隆抗體濃度不同、染色方法不同和研究的患者群不同。TTF-1表達(dá)為何與患者生存相關(guān)的原因尚不清楚。但研究[41]表明TTF-1可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與血管形成，促進(jìn)腫瘤生長。TTF-1的表達(dá)與腫瘤的分化程度負(fù)相關(guān)[36]。TTF-1參與肺分化基因的調(diào)控，包含SP-A、SP-B、SP-C和10 kDa Clara細(xì)胞基因啟動(dòng)子，這一點(diǎn)支持了TTF-1的表達(dá)與細(xì)胞分化相關(guān)[43]。此外，有研究[44]認(rèn)為SP-A和Clara細(xì)胞基因啟動(dòng)子的表達(dá)是早期NSCLC患者生存期延長的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。最近TTF-1的抑癌作用也被報(bào)道，TTF-1下調(diào)與腫瘤進(jìn)展和獲得轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，其原因是在K-ras/p53突變的情況下，HMGA2基因被敲除，解除了阻遏[45]。

Napsin A是繼TTF-1之后又一個(gè)在預(yù)后中受到關(guān)注的肺ADC診斷型標(biāo)志物，但有關(guān)Napsin A對肺癌患者的預(yù)后意義研究較少。Lee等[35]研究發(fā)現(xiàn)，單因素生存分析顯示TTF-1表達(dá)陽性預(yù)后較好，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；相反，多因素分析顯示，無論TNM分期情況怎樣，Napsin A是一個(gè)比TTF-1更有利的獨(dú)立預(yù)后因素。

目前研究認(rèn)為Napsin A可影響肺癌的進(jìn)展。有研究者[46]發(fā)現(xiàn)致瘤性腎HEK293細(xì)胞系中Napsin A表達(dá)抑制腫瘤生長。有研究[34]觀察到分化較好的肺ADC中Napsin A表達(dá)超過低分化的ADC。

查閱文獻(xiàn)未見到有關(guān)CK7直接與肺ADC患者生存有關(guān)的報(bào)道。但早先有研究[47]發(fā)現(xiàn)CK7的五個(gè)亞型與肺ADC的不良預(yù)后明顯相關(guān)。

3 小結(jié)和展望

上述標(biāo)志物診斷肺SQCC和ADC最大的問題是單獨(dú)應(yīng)用的敏感性和特異性還不足以進(jìn)行精確亞分型，通過聯(lián)合幾個(gè)IHC標(biāo)志物作為一個(gè)整體進(jìn)行診斷，可能是今后的一個(gè)趨勢。雖然以往的研究顯示診斷肺SQCC和ADC的IHC指標(biāo)在評估患者的預(yù)后方面有一定的價(jià)值，但這些研究結(jié)果尚不確定，而且有些結(jié)果相互矛盾。因此這些指標(biāo)與肺SQCC和ADC患者預(yù)后的關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。