谷記平，袁海波，趙淑娟

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,浙江杭州 310008；2.杭州師范大學(xué),浙江杭州 311121)

L-茶氨酸（L-Theanine），是在茶葉中發(fā)現(xiàn)的一種游離形式的非蛋白氨基酸，在其他植物中較為罕見?；瘜W(xué)上系統(tǒng)命名為N-乙基-γ-L-谷氨酰胺 （N-ethyl-γ -L-glutamine）， 分 子 式 為 ：HOOCCHNH2CH2CH2CONHCH2CH3，分子量為174.2。自然界中存在的茶氨酸均為L型，純品為白色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)217～218℃，極易溶于水，不溶于無水乙醇和乙醚，具有焦糖的香味和類似味精的鮮爽味。因L-茶氨酸所擁有的特殊風(fēng)味和生物活性而具有重要應(yīng)用價值，例如，茶氨酸能降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[1]，能提高人腦中5-羥色胺、多巴胺和γ-氨基丁酸的濃度水平而起到保護(hù)神經(jīng)的作用[2]等，并已成為茶葉中功能活性成分的研究熱點(diǎn)。本文對近年來有關(guān)原料對L-茶氨酸含量的影響，以及L-茶氨酸的提取制備、生物活性等方面進(jìn)行綜述，以期幫助人們了解其研究進(jìn)展，為相關(guān)研究工作者提供資料。

1 原料和飲用方法對茶氨酸的影響

茶樹的生長狀況、不同的原料來源對茶氨酸的含量有重要影響。隨著茶樹葉齡的增長，L-茶氨酸的含量下降[3]；當(dāng)肥料中磷缺乏時，綠茶中茶氨酸的含量下降[4]；茶芽的茶氨酸含量比成熟茶芽高[5]。

Lu 等[6]在Caco-2 細(xì)胞模型實驗中發(fā)現(xiàn)，純茶氨酸以被動擴(kuò)散方式通過細(xì)胞膜，具有良好的吸收性，而綠茶提取物中的茶氨酸因為茶葉中的其它組分影響其吸收性。在飲用方面，Keenan 等[7]發(fā)現(xiàn)，沖泡時間是提取L-茶氨酸的主要決定因素，添加少量的牛奶和糖對提取率沒有影響。Baptist等[5]發(fā)現(xiàn)，歐洲唯一出產(chǎn)的Azorean 綠茶中茶氨酸的含量為3.1%，而中國大陸、日本、韓國和中國臺灣綠茶中平均茶氨酸含量分別為1.52%、1.34%、0.89%、2.76%。Pijl 等[8]將 25～100 mg L-茶氨酸以茶、富含茶氨酸的茶、生物合成的L-茶氨酸水溶液三種形式提供給志愿者服用，然后分析血清中L-茶氨酸的濃度，發(fā)現(xiàn)所有組滯后時間均在10 min左右，吸收和代謝清除的半衰期分別是15 min和65 min，血清中茶氨酸含量與攝入劑量成比例，說明L-茶氨酸的攝入形式對吸收和代謝沒有明顯影響。

2 茶氨酸的制備

雖然超臨界CO2萃取是一種高效的茶葉活性化合物提取方法，但是高昂的設(shè)備和生產(chǎn)成本限制了它的應(yīng)用，與攪拌、超聲、微波或酶處理相結(jié)合的浸泡提取方法是目前茶葉中活性物質(zhì)提取的工業(yè)化方法。其中，微波處理對溶質(zhì)內(nèi)外同時加熱，劇烈破壞植物組織和細(xì)胞而有利于有效成分溶出，具有升溫快、提取效率高、溶劑消耗低、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，被人們普遍認(rèn)為是提取茶氨酸的一種高效方法，但Vuong[9]研究發(fā)現(xiàn)，采用沖泡的方法即可提取出茶葉中80%的茶氨酸（10 mg/g），微波輔助提取法對茶氨酸的提取率沒有顯著影響，茶葉煮制液的酸堿度對茶氨酸的提取率有顯著影響，煮制液最佳pH 值宜控制在3～5.3 之間[10]。

為了降低L-茶氨酸提取的成本，葛艷[11]從價格相對低廉的夏秋綠茶中提取茶氨酸，最佳提取工藝條件為料液比1:20，提取溫度95℃，提取時間45 min，提取液經(jīng)過NKA-Ⅱ樹脂吸附、洗脫，茶氨酸得率可達(dá)到75.12%。Zhang 等[12]使用表面活性劑雙水相系統(tǒng)對茶多酚的生產(chǎn)廢水開展了茶氨酸的富集和提取研究。為了增大提取效益，周楚儀等[13]通過研究從茶葉提取茶多酚后的殘留液中提取茶氨酸，采用凝絮、活性炭吸附等預(yù)處理，再經(jīng)由陽離子交換樹脂（732型）動態(tài)吸附、洗脫、濃縮、結(jié)晶而得，所制得茶氨酸粗品提取率為3.07%，純度在99.5%以上，該項研究不僅能解決低成本高純度茶氨酸的生產(chǎn)工藝，還可有效緩解困擾茶多酚生產(chǎn)廠家在生產(chǎn)過程中廢液環(huán)境污染問題，變廢為寶，顯著提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。Wang 等[14]開發(fā)了一種高效、流程簡單的柱層析方法，從綠茶提取物中同時分離多酚物質(zhì)、咖啡因和茶氨酸，純度分別達(dá)到99%、98%和98%，實現(xiàn)了多物質(zhì)同時提取。

3 茶氨酸的合成

如上所述，從茶葉中提取、分離L-茶氨酸，因其含量低，成本比較昂貴，因此需要從上游技術(shù)上解決L-茶氨酸的含量問題，然后再進(jìn)行提取分離純化，這樣能更好地提高L-茶氨酸的制備效率。

陳銀霞等[15]用L-谷氨酸為主要原料，以化學(xué)合成方法合成了L-茶氨酸。然而，化學(xué)合成固然易于工業(yè)化生產(chǎn)，且很大程度上降低生產(chǎn)成本，獲得高純度L-茶氨酸，但作為化學(xué)合成而得到的產(chǎn)品并不可取，無法和純天然來源的高純度L-茶氨酸產(chǎn)品做比較，同時化學(xué)合成中還存在消旋問題，容易產(chǎn)生DL-型消旋體。L-茶氨酸化學(xué)合成過程中副產(chǎn)物不可避免，茶氨酸化學(xué)合成的產(chǎn)品也存在一定的安全性問題，因此L-茶氨酸用作多種食品添加劑尚有廣闊的研究空間。

人們嘗試通過γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶 （GGT）或谷氨酰胺酶進(jìn)行酶法制備L-茶氨酸。孫帥[16]優(yōu)化了重組γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶粗酶液催化L-谷氨酰胺和乙胺生成茶氨酸的反應(yīng)條件，茶氨酸產(chǎn)量可達(dá)26.45 g/L，底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)86%。Chen 等[17]研究了由大腸桿菌BL21 分泌的枯草芽孢桿菌GGT 的酶學(xué)性質(zhì)，得到其酶法合成L-茶氨酸的最佳條件。Yokoyama[18]和Itoh[19]分別報道了一種在介孔硅材料上固定化谷氨酰胺酶再由其催化合成L-茶氨酸的方法。Liu 等[20]采用靜電紡絲技術(shù)得到平均直徑為220 nm 的納米纖維，用其固定化假單胞菌Pseudomonas nitroreducens LY，再由固定化的假單胞菌將谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化為L-茶氨酸，轉(zhuǎn)化率可達(dá)20.55%，得率可達(dá)10.74 g/L。李勤等[21]將來源于E.coli DH5α的 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因 （γ-Glutamyltranspeptidase,GGT）克隆到高表達(dá)質(zhì)粒pET-32α中，并轉(zhuǎn)化E.coli BL21，構(gòu)建茶氨酸生物合成的工程菌，該工程菌在一定條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的酶活力可達(dá)(4.41±0.17)U/mL，是出發(fā)菌株E.coli DH5α的18.4倍；直接以工程菌為催化劑，在谷氨酰胺和乙胺鹽酸鹽為底物、在一定條件下反應(yīng)6 h，茶氨酸合成量可達(dá)12.6 mg/mL，L-谷氨酰胺轉(zhuǎn)化率為41.05%。

4 茶氨酸的生物活性

近年對L-茶氨酸生物活性的研究主要集中在茶氨酸的抗氧化、對神經(jīng)的保護(hù)作用和抗腫瘤方面。劉曉慧等[22]發(fā)現(xiàn)茶氨酸和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對ABTS 自由基及-OH 自由基的清除有協(xié)同增效作用，對DPPH 自由基無協(xié)同作用；它們還可以協(xié)同降低細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基及脂質(zhì)過氧化水平，提高谷胱甘肽過氧化物酶的活性，從而協(xié)同降低細(xì)胞所受的氧化損傷。Jiang 等[23]發(fā)現(xiàn)L-茶氨酸劑量依賴型地抑制大鼠中CCl4引起的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的活性和膽紅素水平的升高以及組織病理學(xué)改變，能顯著預(yù)防CCl4引起的脂過氧化產(chǎn)生及降低肝谷胱甘肽含量，使和抗氧化酶的活性下降，還能抑制氧化應(yīng)激引起的包括血清中TNF-α和IL-1β升高在內(nèi)的炎癥反應(yīng)；李桂蘭等[24]發(fā)現(xiàn)，L-茶氨酸能提高H2O2損傷的L02 細(xì)胞存活率，減少乳酸脫氫酶（LDH）的滲漏，降低肝細(xì)胞凋亡，且通過抑制Caspase-3 的激活和PARP 的切割及Bax/Bcl-2 比值的升高而發(fā)揮抗凋亡的作用。Gong等[25]發(fā)現(xiàn)茶氨酸能延長秀麗小桿線蟲（Caenorhabditis elegans）在熱應(yīng)激和氧應(yīng)激下的平均壽命（分別延長12.8%和21.3%），但并不能延長正常培養(yǎng)條件下的線蟲的存活時間。李桂蘭等[26]研究發(fā)現(xiàn)，L-茶氨酸顯著性保護(hù)肝細(xì)胞免受酒精引起的細(xì)胞毒性作用，抑制酒精引起的L02細(xì)胞的凋亡，抑制酒精處理的L02 細(xì)胞中線粒體膜電位的損失，防止細(xì)胞色素C 從線粒體釋放。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，L-茶氨酸能顯著抑制酒精引起的ALT、AST、甘油三酯（TG）和丙二醛（MDA）的升高。有研究表明L-茶氨酸可通過穩(wěn)定人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞線粒體膜電位，減輕疊氮鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體的損傷[27]，茶氨酸抑制攝食和胃排空作用可能與抑制下丘腦外側(cè)核的NMDA受體和AMPA 受體有關(guān)[28]。Kim 等[29]發(fā)現(xiàn)茶氨酸能調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞的自我更新。SabryAttia[30]發(fā)現(xiàn)，用30 mg/kg 和60 mg/kg 的劑量飼喂大鼠12 d，茶氨酸無遺傳損傷和細(xì)胞毒性作用，用茶氨酸預(yù)先飼喂大鼠，能顯著減輕抗腫瘤藥物伊立替康（Irinotecan）引起的髓細(xì)胞遺傳損傷，且該效果呈劑量相關(guān)。

L-茶氨酸對心理、社會壓力下的人與動物有顯著的抗壓效果。在美國，綠茶中的L-茶氨酸被作為一種膳食添加物出售，用來減輕人的精神壓力，改善感知和情緒。Unno K 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，早晨唾液中α-淀粉酶活力高的學(xué)生表現(xiàn)出顯著性的特質(zhì)焦慮，并且高α-淀粉酶活力與睡眠時間短有關(guān)，而攝入茶氨酸藥片學(xué)生組的α-淀粉酶活力及主觀應(yīng)激水平均較低，說明茶氨酸的攝入能抑制初始的應(yīng)激響應(yīng)。Wise 等[32]發(fā)現(xiàn)L-茶氨酸能減輕嗎啡依賴癥的恒河猴體內(nèi)的阿片樣物質(zhì)退化現(xiàn)象，認(rèn)為茶氨酸能用于治療阿片物質(zhì)濫用和焦慮引起的相關(guān)精神紊亂。內(nèi)皮NO 是調(diào)節(jié)內(nèi)皮血管功能的關(guān)鍵物質(zhì)，Siamwala 等[33]證明L-茶氨酸能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中NO 的生成。Higashiyama等[34]發(fā)現(xiàn)L-茶氨酸對18個健康大學(xué)生志愿者的注意力和反應(yīng)時間響應(yīng)有顯著影響。Jang 等[35]發(fā)現(xiàn)，低劑量的L-茶氨酸能部分逆轉(zhuǎn)咖啡因引起的慢波睡眠下降，但是對咖啡因引起的失眠，L-茶氨酸的效果無劑量依賴關(guān)系。Ritsner 等[36]報道了將孕烯醇酮和L-茶氨酸配伍使用能用來治療精神分裂癥中的陰性但焦慮的癥狀。彭彬等[37]研究了L-茶氨酸對慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激模型大鼠的抗抑郁作用，指出其機(jī)制主要與促進(jìn)單胺類遞質(zhì)分泌有關(guān)。楊怡[38]研究發(fā)現(xiàn)茶氨酸和氟西汀均能有效改善抑郁模型大鼠的抑郁行為，并指出茶氨酸的抗抑郁作用機(jī)制可能和氟西汀類似。

L-茶氨酸在經(jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖中也有應(yīng)用前景，據(jù)報道[39]L-茶氨酸可提高黃羽肉雞生長前期腸道sIgA 含量、后期血清IL2 的含量及全期血清IFNγ的含量，從而增強(qiáng)其機(jī)體免疫功能。

對L-茶氨酸生物活動研究的開展為進(jìn)一步更好地綜合利用茶氨酸提供了廣闊的空間，但是其潛在功效還有待廣大相關(guān)工作者去研究和發(fā)現(xiàn)。

5 茶氨酸結(jié)構(gòu)改性后的生物活性

就其直接的抗癌應(yīng)用方面，L-茶氨酸本身也存在諸多的不足，基于L-茶氨酸的相關(guān)結(jié)構(gòu)特性和生理活性，吳菲等[40]以茶氨酸為母體化合物，對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步改造，成功獲得了它的衍生物茶氨酸氯香酰胺，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了茶氨酸以及茶氨酸氯香酰胺的抗癌作用。實驗結(jié)果顯示，隨著濃度的增高，茶氨酸和茶氨酸氯香酰胺對人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞體外生長的抑制作用逐漸增強(qiáng)，茶氨酸氯香酰胺的抑制作用要明顯強(qiáng)于茶氨酸，茶氨酸和茶氨酸氯香酰胺均能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)水平，同時上調(diào)促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)水平，使Bcl-2/Bax 比率減少。此外，茶氨酸和茶氨酸氯香酰胺均能抑制血管內(nèi)皮生長因子受體VEGFR1 和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)，而茶氨酸氯香酰胺的抑制作用要明顯強(qiáng)于茶氨酸并推測茶氨酸和茶氨酸氯香酰胺對這些蛋白水平的調(diào)節(jié)作用可能是抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長的重要機(jī)制之一，并指出茶氨酸和茶氨酸氯香酰胺對治療高轉(zhuǎn)移的人乳腺癌可能具有廣闊的應(yīng)用前景。季德鑫等[41]對茶氨酸進(jìn)行了必要的結(jié)構(gòu)修飾和改造，合成了茶氨酸的衍生物茶氨酸溴香酰胺，以L-茶氨酸作對照，評估茶氨酸溴香酰胺對人肝癌HepG2 細(xì)胞系體內(nèi)外生長的抑制作用，并初步探究其作用的分子機(jī)制。實驗結(jié)果顯示，茶氨酸溴香酰胺抑制人肝癌細(xì)胞體內(nèi)外生長的活性超過其母體化合物茶氨酸分別為3倍和4倍以上，對小鼠生長無明顯毒性。茶氨酸溴香酰胺比茶氨酸更顯著地抑制肝癌細(xì)胞生長因子受體c-Met 和抗凋亡的Bcl-2 等蛋白的表達(dá)；茶氨酸溴香酰胺能大大上調(diào)促進(jìn)凋亡的Bax 蛋白的表達(dá)；茶氨酸溴香酰胺能抑制c-Met 信號傳導(dǎo)通路，下調(diào)Bcl-2/Bax 蛋白比率可能是其作用的分子機(jī)制之一；由此認(rèn)為茶氨酸溴香酰胺具有廣泛應(yīng)用于臨床治療和（或）輔助治療人肝癌和其他癌癥的潛力。此外，該作者還建立了動物腫瘤模型，與對照組茶氨酸和臨床常用抗癌藥物五氟尿嘧啶組相比較，評價茶氨酸溴香酰胺對荷瘤裸鼠人肝癌HepG2 腫瘤生長的抑制效果。張華榮等[42]研究了茶氨酸和茶氨酸溴香酰胺對人宮頸癌細(xì)胞體內(nèi)外生長的抑制作用及其分子機(jī)制，實驗結(jié)果顯示，茶氨酸溴香酰胺抑制人宮頸癌細(xì)胞體內(nèi)外生長的活性超過其母體化合物茶氨酸數(shù)倍，對小鼠生長無明顯毒性；茶氨酸溴香酰胺作用的分子機(jī)制之一可能是其與抑制VEGFR1-Bcl-2/Bax 有關(guān)。建立的動物腫瘤模型試驗也表現(xiàn)出茶氨酸溴香酰胺對荷瘤裸鼠人宮頸癌生長的抑制效果。

6 展望

自L-茶氨酸被發(fā)現(xiàn)以來，隨著對L-茶氨酸研究的深入，越來越廣泛的生物活性被發(fā)現(xiàn)，引起了人們的極大關(guān)注，而在繼續(xù)發(fā)掘L-茶氨酸的其他有益于人體健康的生物活性方面還有大量的工作可做。目前人們在L-茶氨酸的制備方面主要是提取和酶合成方法，隨著生物技術(shù)和分子生物學(xué)的日益成熟，基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程等技術(shù)在L-茶氨酸生產(chǎn)方面將大有作為。待這些技術(shù)壁壘突破后，再進(jìn)行高科技、低成本、大規(guī)模的茶氨酸生產(chǎn)，使其產(chǎn)品更加服務(wù)于廣大民眾，成為大眾消費(fèi)品。L-茶氨酸在貯藏、加工過程中的變化研究，L-茶氨酸與其他物質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)研究也還留有大量的空白，兒茶素的甲基化一樣在茶氨酸的改性方面研究和應(yīng)用也有待進(jìn)一步推進(jìn)。以上領(lǐng)域都還有待廣大茶葉、醫(yī)學(xué)工作者去研究和發(fā)現(xiàn)。

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