張建英，毛向紅，張瑩瑩

(1.河北省林木良種工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050061；2.河北省林業(yè)科學(xué)研究院，河北 石家莊 050061)

酸棗Ziziphus acidojujubaC.Y原產(chǎn)我國，在我國分布極為廣泛，是棗的原生種，距今已有1 200萬年以上的歷史[1]。酸棗具有較高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，其保健功能早已得到了人們的認(rèn)可，以酸棗為原料的加工產(chǎn)品受到了現(xiàn)代人的青睞。目前有關(guān)酸棗的研究主要集中在果肉、種仁、酸棗葉等器官的營養(yǎng)價(jià)值和藥理作用以及加工等方面。

遺傳多樣性具有廣泛性、特異性和適應(yīng)性等特點(diǎn)，遺傳變異廣泛存在于自然界各種生物體內(nèi)，是生物進(jìn)化的根本動(dòng)力[2]。酸棗在長期的進(jìn)化過程中，經(jīng)過自然選擇和人為因素的綜合作用，產(chǎn)生了大量的變異，種質(zhì)資源極為豐富。關(guān)于酸棗分子水平上的研究報(bào)道較為鮮見，為了更好地開發(fā)利用酸棗資源，獲得更高的效益，有必要對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的遺傳學(xué)研究[3]。近年來，隨著對(duì)棗種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的起步，分子標(biāo)記技術(shù)在棗種質(zhì)資源鑒定方面的應(yīng)用逐漸增多，劉孟軍[4]首次采用RAPD分析方法，將親緣關(guān)系極近的金絲小棗和無核小棗區(qū)分開來。趙錦[5]通過RAPD分析從DNA水平上揭示了棗屬中棗、酸棗和毛葉棗3個(gè)種之間的親緣關(guān)系，同時(shí)建立了供試材料的RAPD指紋。但RAPD技術(shù)對(duì)外界條件的微小變化反應(yīng)太過敏感，受反應(yīng)條件的影響較大，相對(duì)來說，RAMP技術(shù)能更準(zhǔn)確地揭示物種間的遺傳關(guān)系[6]。本試驗(yàn)中嘗試用RAMP技術(shù)對(duì)31份采自不同區(qū)域的酸棗種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在闡明該樹種不同區(qū)域生長群體間存在的遺傳差異，保護(hù)該樹種基因資源多樣性，同時(shí)為酸棗新品種培育工作的種源選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)中所用酸棗樣品于2011年7月采自河北省的石家莊、懷來、赤城、遵化、隆化、涉縣，山西省的汾陽以及遼寧省。樣品共計(jì)31份(見表1)，包括27份酸棗資源、4個(gè)大棗品種。1～21號(hào)樣品采自從原產(chǎn)地引進(jìn)接穗嫁接到河北省林業(yè)科學(xué)研究院資源圃的植株。

表1 供試酸棗樣品Table 1 The tested samples in Z.acidojujuba

采集健康植株的幼嫩葉片，采后立即用錫箔紙包裹并置于液氮瓶中冷凍，帶回后存放于-70℃的超低溫冰箱中待測(cè)。

試驗(yàn)中所用引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；TaqDNA聚合酶和dNTP購自大連寶生物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取

酸棗基因組DNA的提取采用改良CTAB法[7]。

(1)將高鹽CTAB緩沖液在65℃離心管中預(yù)熱處理。

(2)稱取150mg新鮮、干凈酸棗葉片置于1.5mL離心管中，先加入500μLDNA預(yù)處理液快速研成粉末，再加入500μL預(yù)處理液，然后與預(yù)熱的高鹽CTAB 緩沖液充分混勻，65℃水浴條件下60min，其間上下顛倒混勻幾次。

(3)取出離心管，室溫下冷卻4～5min，吸取上清液，加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液(25︰24︰1)混勻，室溫下靜置5min，于室溫下12 000g離心8min。

(4)取上清液，加入等體積的氯仿、異戊醇混合液(24︰1)，充分混勻后室溫靜置5min，室溫下12 000g離心8min；取上清液，重復(fù)加等體積氯仿、異戊醇混合液(24︰1)抽提。

(5)取上清液，加入等體積氯仿抽提1次。

(6)取上清液，加入2倍體積的-20℃的無水乙醇，輕輕混勻，-20℃沉淀30min以上，12 000g離心10min。

(7)將所得沉淀風(fēng)干至透明狀，然后溶于100μL水中，放于4℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)與電泳[5]

優(yōu)化酸棗DNA基因組RAMP-PCR 10μL反應(yīng)的最優(yōu)條件為：Mg2+濃度3.0mmol/L，引物濃度1.0 μmol/L，dNTPs濃度 0.15mmol/L，TaqDNA 酶為1.5 U。

擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：95℃，4min；95℃，50s；50℃，50s；72℃，1.5min，共30個(gè)循環(huán)。完成最后1個(gè)循環(huán)后72℃下延伸10min。

反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，0.1％ AgNO3染色10min，顯色液(1.5％NaOH，0.4％甲醛)顯色，然后用10％乙醇0.5％乙酸固定，最后觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 31份樣品的RAMP分析

RAMP擴(kuò)增選用5′錨定的引物即 GC(CA)4和GT(CA)4與上海生工生物工程公司生產(chǎn)的十聚體隨機(jī)引物組成對(duì)材料進(jìn)行擴(kuò)增篩選，從中共篩選出具有明顯擴(kuò)增產(chǎn)物的14條引物組合用于試驗(yàn)。擴(kuò)增結(jié)果見表2。由表2可以看出，RAMP1+S427、RAMP+S485、RAMP+S26引物組合多態(tài)性較高，達(dá)到90％以上；RAMP1+S372引物組合最低，為33.3％；其余引物介于中間。14條引物共擴(kuò)增出112條DNA片段，其中87條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為77.7％，每個(gè)引物擴(kuò)增出1～10條多態(tài)性帶，平均每條引物擴(kuò)增6.2條，說明采集的樣品在分子水平上存在較大的差異。

圖1為以RAMP1+RAMP2F組合為引物的部分酸棗PCR樣品電泳圖譜，以RAMP為引物得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小主要分布在300～700 bp之間。

表2 14條引物對(duì)酸棗樣品的擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Amplification result of the samples in Z.acidojujuba by using 14 primers

圖1 以RAMP1+RAMP2F為引物的部分酸棗PCR樣品電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of partial PCR samples in Z.acidojujuba by using RAMP1+RAMP2F as the primer

2.2 31份樣品的的遺傳關(guān)系分析

對(duì)31份樣品經(jīng)RAMP-PCR擴(kuò)增的300～700 bp范圍內(nèi)條帶分別賦值，同一位置有帶的記為1，無帶的記為0。按照Nei和Li方法計(jì)算遺傳相似系數(shù)[8]。根據(jù)14條引物對(duì)樣品基因組DNA的隨機(jī)擴(kuò)增結(jié)果，通過計(jì)算，建立樹狀聚類圖(見圖2)。由圖2可知，31份樣品間的遺傳距離范圍為0.120 9～0.517 2。其中，3號(hào)井22A和6號(hào)井22C間遺傳距離最小，為0.120 9；5號(hào)井21和其它樣品間遺傳距離均較大，與27號(hào)新立河南1的遺傳距離最大，為0.517 2。

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果將參試的31份樣品在遺傳距離0.34處做結(jié)合線，可將其分為6大類。

第1大類包括18份樣品，可以將其分為3組：第1組包括1號(hào)、8號(hào)、13號(hào)、 3號(hào)、6號(hào)、10號(hào)、4號(hào)、7號(hào)、9號(hào)、24號(hào)10個(gè)酸棗樣品和20號(hào)、21號(hào)2個(gè)大棗品種；第2組包含2號(hào)、16號(hào)、15號(hào)3個(gè)酸棗樣品和1個(gè)大棗樣品(18號(hào)唐星)；第3組為12號(hào)和14號(hào)樣品。這一類中除了第1組中的20號(hào)、21號(hào)2個(gè)大棗品種和24號(hào)酸棗樣品外，其它15份樣品均原產(chǎn)于河北省中南部的石家莊和保定。

第2大類包括11份樣品，可以分為2組：第1組為22號(hào)、23號(hào)、27號(hào)、29號(hào)、30號(hào)、28號(hào)6個(gè)樣品，采自河北省東北部的懷來、遵化以及與河北東北部交界的遼寧省；第2組為25號(hào)、26號(hào)和31號(hào)3份樣品，采自河北省的隆化、涉縣和山西汾陽。

第3～6大類各只包括1份樣品，分別為11號(hào)‘武GY08’、19號(hào)‘曙光’、5號(hào)‘井21’、17號(hào)‘易GY13’，均來源于河北中南部。

圖2 31份酸棗樣品聚類分析Fig.2 Cluster analysis on 31 samples in Z.acidojujuba

3 結(jié)論與討論

樣品多態(tài)性分析結(jié)果表明，在24條引物中篩選出14條對(duì)31份樣品進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出112個(gè)片段，其中87條具有多態(tài)性，占總擴(kuò)增帶數(shù)的77.7％，顯示出供試樣品具有豐富的遺傳多樣性。表明利用RAMP分子標(biāo)記技術(shù)能夠把供試材料區(qū)分開并表明它們之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用能夠?yàn)樗釛椘贩N鑒定、保護(hù)及應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

樣品的聚類分析結(jié)果表明，最少通過4對(duì)引 物(RAMP1+S427、RAMP1+S485、RAMP1+RAMP2F、RAMP1+S26)可以對(duì) 31個(gè)酸棗品種進(jìn)行聚類；31份樣品間的遺傳距離為0.120 9～0.517 2，3號(hào)井22A和6號(hào)井22C間遺傳距離最小，而且二者產(chǎn)地相同，由此推斷在起源上有共同的遺傳來源；5號(hào)井21與其它樣品間遺傳距離較大，與27號(hào)新立河南1的遺傳距離最大，表明二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果可將參試的31份資源劃分為6類，酸棗資源沒有首先聚成一類，和4個(gè)大棗品種之間也無明顯的分類界限，有的酸棗之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)于大棗，冬棗、新星、唐星、曙光4個(gè)大棗品種也未聚成一類。棗與酸棗均屬于鼠李科棗屬植物，但二者的分類存在較大爭(zhēng)議[9]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行推測(cè)，酸棗向大棗演變的過程是極為復(fù)雜的，不同區(qū)域酸棗的進(jìn)化階段并不相同，酸棗向大棗的進(jìn)化是通過多條路徑在不同的地理區(qū)域完成的。

在每一類組里除了個(gè)別樣品外大都表現(xiàn)為地理位置接近的資源聚為一組，表現(xiàn)出了地源優(yōu)先的原則，但也有個(gè)別樣品例外。酸棗的發(fā)展演變經(jīng)歷了上千萬年的歷史，一些個(gè)體從一個(gè)群體到另一個(gè)群體的遷移會(huì)把某種基因帶到新的群體，從而產(chǎn)生基因的流動(dòng)?；ǚ酆头N子的擴(kuò)散與傳播更是自然界普遍存在的現(xiàn)象，這2種傳播方式是基因流動(dòng)的主要形式[10]。因此，個(gè)別樣品的聚類可能受到試驗(yàn)過程中的誤差或者資源本身曾經(jīng)經(jīng)歷的基因流動(dòng)[11-13]的影響。

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