傅本重，王立華，李國元，徐東生，王有寧，章愛群，鄒禮平

(湖北工程學(xué)院 a.特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室；b.生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000)

板栗Castanea mollissima為殼斗科栗屬植物，是原產(chǎn)于我國的重要干果類經(jīng)濟(jì)樹種，已有數(shù)千年的栽培歷史[1]。板栗是我國重點規(guī)劃發(fā)展的經(jīng)濟(jì)林樹種之一，全國種植面積達(dá)2.0×106hm2，年產(chǎn)量達(dá)1.5×106t以上，且逐年遞增[2]。但是，因病蟲害引起的板栗減產(chǎn)常達(dá)20％～80％，甚至造成絕收[1,3]，其中，由多種病原菌復(fù)合侵染的板栗實腐病(chestnut seed rot)是一種重要的板栗采后病害[4-5]，病害導(dǎo)致板栗的種仁變成土灰色、黃褐色至黑褐色，失去食用價值，是嚴(yán)重制約板栗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制因素。

劉建華等從病栗的種仁中分離出了11個不同屬的真菌和1種細(xì)菌，主要病原菌有Dothiorella gregaria、Colletotrichum gloeosparioides和Trichotheciu mroseum[6]。江蘇新沂板栗實腐病的首要致病菌是炭疽菌C.gloeosporioides或小穴殼菌D.gregaria[7]。北京地區(qū)板栗實腐病的病原菌有5 種，強致病菌有C.gloeosporioides和D.gregaria，弱致病菌Fusarium solani,Phomopsissp.和Rhizopusstolonifer[4]。而王曉明等認(rèn)為板栗堅果在貯藏期腐爛首先是由于生理傷害，其次才是病菌侵染[8]。這也可能是導(dǎo)致從板栗實腐病上分離出多種病原菌的原因之一。

ITS-RFLP是一種常用的病原菌多樣性研究方法[9-10]。湖北板栗實腐病菌的種類報道較少。本文對分離自湖北省大悟縣的11株板栗實腐病菌進(jìn)行了初步研究，通過rDNA-ITS-RFLP進(jìn)行了遺傳多樣性研究，并對病菌的ITS進(jìn)行了測序和比對分析，研究結(jié)果可為進(jìn)一步認(rèn)識板栗實腐病菌的多樣性和板栗貯藏期的病害管理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

板栗實腐病感病栗于2012年10月采集于湖北省孝感市大悟縣芳畈鄉(xiāng)板栗林(N31°23′30.88″，E114°06′19.31″)，接種用的健康板栗購自本地市場。

1.2 病原菌的分離與保存

對板栗實腐病病栗除殼后按照常規(guī)組織分離法進(jìn)行[11]。病原菌在PSA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂15g，水1 000mL)上28℃條件下培養(yǎng)，進(jìn)行5次以上邊緣挑取菌絲接種新鮮培養(yǎng)基純化。用菌絲塊接種于健康板栗上，置于20℃保濕培養(yǎng)，完成科赫氏法則驗證。菌株編號后接種PSA試管斜面，在4℃環(huán)境里保存。

1.3 病原菌的生長速率和致死溫度測定

將活化的菌落打成直徑7mm的菌餅，置于新鮮的PSA平板中央，在28℃下培養(yǎng)。每天測量菌落直徑，直至菌落將要長滿整個平板。測量菌落直徑的變化量并計算其生長速率。

將生長旺盛的病原菌菌落打成直徑為7mm的菌餅，置于5mL無菌水的試管，每管里放5個菌餅。分別設(shè)置40、45、50、55、60、65和70℃共7個溫度梯度。在不同溫度的水浴鍋中水浴10min，取出菌餅接種于PSA上，28℃下培養(yǎng)。3d后觀察是否有菌絲生長，通過不同的溫度試驗以確定致死溫度。

1.4 病原菌的產(chǎn)酶能力試驗

1.4.1 纖維素酶測定

纖維素酶活性用1％的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為底物進(jìn)行測定[12]。配制含1％CMC的固體培養(yǎng)基，接種病原菌，待長出菌落后用1mg/mL的剛果紅溶液染色1h，用1mol/L的NaCl溶液浸泡30min。纖維素可與剛果紅染料反應(yīng)顯剛果紅色，不與纖維素水解產(chǎn)物纖維二糖和葡萄糖顯色。根據(jù)其周圍是否產(chǎn)生水解圈來判斷酶活性。

1.4.2 過氧化氫酶試驗

以鉑絲接種針挑取少量菌絲涂抹于已加有10％過氧化氫的玻片上。觀察是否產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生則為陽性，無氣泡則為陰性[13]。

每個處理3個重復(fù)測試酶活性，試驗重復(fù)1次。

1.5 病原菌rDNA-ITS 的PCR擴(kuò)增及RFLP分析

病原菌基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。

用通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAA CAAGG-3’)PCR擴(kuò)增ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列[15]。引物由上海Invitrogen公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 25μL：12.5μL2×EasyTaqSuperMix(北京全式金)，ITS4(10 μmol/L)和ITS5(10 μmol/L)各 1.0μL，9.5μLddH2O，模板 DNA 為1μL。PCR循環(huán)：94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，50℃退火50s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸 10min。

rDNA-ITS經(jīng)PCR擴(kuò)增后，分別用EcoRⅠ、HaeⅢ和TaqⅠ限制性內(nèi)切酶(BBI)進(jìn)行酶切。酶 切 體 系總體積 20μL：6μLPCR 產(chǎn) 物，2μLbuffer，1μL酶，11 μLddH2O。EcoRⅠ和HaeⅢ酶切在37℃下進(jìn)行，TaqⅠ酶切在65℃下進(jìn)行，酶切3h。產(chǎn)物經(jīng)1.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后紫外成像系統(tǒng)照相保存。

酶切圖譜以DNA 某一片段在樣品中出現(xiàn)賦值“1”，不出現(xiàn)賦值為“0”，構(gòu)建初始數(shù)據(jù)矩陣。用NTSYSpc2.1專業(yè)版軟件計算遺傳相似系數(shù)，以平均連鎖法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，生成聚類圖。

1.6 病原菌的ITS測序及分析

ITS的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外光下切下大小約500～600 bp的條帶，送上海生工雙向測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在線BLAST比對分析，下載與比對序列一致性最高的序列作進(jìn)化樹分析?；贗TS序列進(jìn)化發(fā)育樹的構(gòu)建用軟件MEGA5.1進(jìn)行，構(gòu)建NJ樹，自檢值Bootstrap取1 000對系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離

板栗實腐病病栗種仁呈現(xiàn)不同顏色，有灰白色、黃褐色和黑褐色等(見圖1a)。對不同癥狀的病樣進(jìn)行病原菌的分離，得到11株真菌，并完成了科赫氏法則驗證，編號分別為B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、S1、S4、X3 和 X6(見圖 1)。

圖1 板栗實腐病病栗及病原菌Fig.1 Chestnut seed rot samples and the colonies of pathogen

2.2 病原菌的生長速率和致死溫度

對11株病原菌在28℃下，PSA培養(yǎng)基上的生長速率進(jìn)行了測定。大多病菌生長速率達(dá)25mm?d-1以上，菌株X3的生長速率為11.7mm?d-1，與其他菌株的生長速率差異明顯(P＜0.01)(見圖2)。

圖2 病原菌菌絲的生長速率Fig.2 Growth velocity of mycelia in pathogens

菌株的致死溫度試驗在濕熱條件下進(jìn)行。菌株 B2和 B4為50℃，B3、B4、B6、B7、B8、S1、S4、X3和X6在55℃處理下可以繼續(xù)生長，60℃下致死。菌株B5能在65℃下繼續(xù)生長，其致死溫度高達(dá)70℃。

2.3 病原菌的纖維素酶和過氧化氫酶活性

纖維素酶測試，菌落周圍都無水解圈，結(jié)果全部為陰性。

經(jīng)過氧化氫酶測試，X6不產(chǎn)生氣泡，結(jié)果為陰性；其余菌株全部產(chǎn)生氣泡，產(chǎn)生氣泡的量有一定差別，結(jié)果均為陽性。

2.4 病原菌的ITS-RFLP分析

PCR擴(kuò)增病原菌的rDNA-ITS序列，得到一條大小為500～600 bp的清晰條帶。與一般真菌的ITS 序列大小相近。分別用EcoRⅠ、HaeⅢ和TaqⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切圖譜統(tǒng)計得出11條清晰易辨的多態(tài)性DNA條帶(見圖3)。

應(yīng)用NTSYSpc2.1專業(yè)版軟件計算得到遺傳相似系數(shù)矩陣。11個板栗實腐病菌株的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.385～1.000，遺傳相似系數(shù)變化較大，遺傳背景豐富。采用UPGMA法對11個供試菌株的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建出11個板栗實腐病菌株的遺傳親緣關(guān)系圖譜(見圖4)。從聚類圖可以看出，在相似系數(shù)為0.72水平下，11個供試菌株可分為4個類群。類群Ⅰ包括菌株B2、B3、B4、B5和 B8；類群Ⅲ包括菌株B6、B7、S1和S4；類群Ⅱ和Ⅳ僅有一個菌株，分別為X3和 X6。

圖3 病菌的ITS-RFLP分析電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis result of ITS-RFLP of pathogens

2.5 病原菌的ITS測序及分析

對11個病原菌的ITS序列進(jìn)行了雙向測序，其大小在600 bp左右。將雙向測序結(jié)果拼接，通過GenBank在線進(jìn)行BLAST搜索。菌株 B2、B3、B4、B5、B7、B8、S1和 S4都能搜索到一致性在99％以上的菌株ITS序列多條，并且屬于不同的種，主要有Diplodia seriata，Botryosphaeria obtusa和B.dothidea。B6與B.dothidea的ITS序列一致性為100％。X3的比對結(jié)果在99％一致性的有F.oxysporum、Gibberella moniliformis和F.proliferatum。菌株X6搜索的結(jié)果與Neofusicoccum parvum的各菌株一致性為100％。

將一致性最大的不同種菌株的ITS序列下載到MEGA5.1，構(gòu)建進(jìn)化發(fā)育樹(見圖5)。用Bootstap 1000對系統(tǒng)樹進(jìn)行了檢驗。進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)與RFLP結(jié)果相似。根據(jù)ITS序列以及形態(tài)觀察，初步確定菌株B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、S1和 S4皆 為Botryosphaeria屬( 無 性 階段Diplodia)，菌株X3為Fusarium屬(有性態(tài)Gibberella)，菌株X6為N.parvum屬。

圖4 基于ITS-RFLP的11個板栗實腐病菌株的聚類圖Fig.4 Dendrogram of 11 strains of chestnut seed rot pathogens based on ITS-RFLP

圖5 基于ITS序列的病原菌及相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of pathogens and similar fungal species based on the ITS sequences

3 討 論

本試驗通過分離來自湖北大悟板栗產(chǎn)區(qū)的板栗實腐病菌，經(jīng)純化共得到了11個菌株。將這些菌株在人工接種條件下接種到果殼完好無傷口的板栗上基本不發(fā)病，而接種到果殼有傷口或者去殼、切開的板栗上則發(fā)病速度很快。這表明板栗實腐病菌菌絲的穿透能力不強，很難侵入到完好的板栗殼內(nèi)。供試菌株的纖維素酶皆呈陰性，這可能是實腐病菌的寄生能力弱的原因之一，并與已有報道關(guān)于一般需要有傷口或是在生理病害發(fā)生之后才引起實腐的結(jié)論相一致[8]。

在28℃環(huán)境條件下，大部分菌株在PSA培養(yǎng)基上的生長速率達(dá)25mm?d-1，菌株X3的生長較慢，僅為11.7mm?d-1。真菌的rDNA-ITS序列分析是一種通用的分子鑒定手段，在大型真菌和雜交竹的病原菌鑒定中有應(yīng)用[16-18]。經(jīng)ITS測序及菌落形態(tài)觀察，菌落背面產(chǎn)生有紅色色素，因此確定X3為鐮刀菌Fusariumsp.，但X3究竟屬于何種則還有待進(jìn)一步確定。

對分離自孝感板栗實腐病的11個菌株的ITS-RFLP進(jìn)行了分析，通過聚類可以將它們分為4個類群，遺傳相似系數(shù)最小為0.385。表明它們來源于不同的種。通過MEGA5.1將它們的ITS序列與NCBI中相似序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定這11個病原菌主要來源于3個 屬：Botryosphaeria( 無 性 態(tài)Diplodia)、Neofusicoccum和Fusarium(有性態(tài)Gibberella)。

B.dothidea是葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae的模式種，分布廣泛，種類繁多，寄主類型多樣，是引起樹木潰瘍病最重要的病原，在我國常引起多種重要的經(jīng)濟(jì)樹木枝條或主干發(fā)生潰瘍病，包括楊樹和多種果樹等，如蘋果的輪紋病[19]，也是金蕎麥和苦蕎麥的內(nèi)生菌[20]。該菌是否為板栗的內(nèi)生菌而且是否會在條件適宜的情況下致病，還有待進(jìn)一步確認(rèn)。其中一個菌株B5的致死溫度高達(dá)70℃，這是否與板栗實腐病不易清除有關(guān)，也有待進(jìn)一步研究分析確認(rèn)。

國內(nèi)報道的板栗實腐病病原菌有10多個屬，據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)[4,21-23]，初步確定小新殼梭孢Neofusicoccum是一個新的引起板栗實腐病的屬。澳大利亞曾有報道N.parvum引起南洋杉潰瘍和衰退病[24]，美國報道該菌引起了弗羅里達(dá)州桃金娘Syzygium paniculatum的死亡[25]。西班牙成熟的鱷梨樹出現(xiàn)枝枯及死亡癥狀，經(jīng)證實病原菌為N.parvum，而該菌曾作為B.parva(葡萄座腔菌屬)的無性階段而被報道。臺灣地區(qū)報道

Neofusicoccum屬真菌引起梨果腐病[26]，該屬病原菌侵染板栗引起病害的機理還需要進(jìn)一步確定。板栗實腐病是在栗樹生長季節(jié)侵染、板栗果實貯運期發(fā)病的一種潛伏侵染病害。在較適宜的貯藏條件下，板栗實腐病的損失約為10％左右；而貯藏不當(dāng)時，損失率可高達(dá)50％[3]。板栗實腐病菌的種類多樣，發(fā)病機理復(fù)雜。近年來關(guān)于病害發(fā)生率的調(diào)查報道較少，但據(jù)多處實地了解，板栗實腐病的發(fā)病率仍然較高。國家林業(yè)局確定了我國26個“板栗之鄉(xiāng)”，并于2012年成立了中國經(jīng)濟(jì)林協(xié)會板栗專業(yè)委員會，板栗是山區(qū)人民脫貧致富的重點林業(yè)產(chǎn)業(yè)，因此控制板栗實腐病有重要的經(jīng)濟(jì)和現(xiàn)實意義。對于板栗實腐病的基礎(chǔ)研究及病害控制亟待進(jìn)一步加強，這樣才有利于我國板栗產(chǎn)業(yè)的健康、快速和可持續(xù)發(fā)展。

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