■ 吳國江 魏 萌 韓愈杰 秦桂芳

(1.河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河北保定071001；2.河北大學中醫(yī)學院，河北保定071001)

隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，蛋雞產(chǎn)蛋率的高低將直接影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟效益，然而在蛋雞飼養(yǎng)管理過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)產(chǎn)蛋率下降的情況，雖造成產(chǎn)蛋率下降的原因很多，但多數(shù)都是因卵泡發(fā)育減少或停滯[1]所致。在正常情況下，卵泡生長、發(fā)育過程易受促卵泡素、促黃體素、雌激素、血清卵黃前體物等多種生理因素影響，其中卵黃前體物極低密度脂蛋白(VLDL)和卵黃生成素(VTG)[2]是蛋黃形成的基礎(chǔ)，二者在卵細胞卵黃生成受體(OVR，oocyte vitellogenesis receptor)[3]介導下，經(jīng)內(nèi)吞方式被轉(zhuǎn)運到卵泡中，并促進卵母細胞成熟[4]，進而提高產(chǎn)蛋率，因此雞細胞卵黃生成受體（OVR）基因表達量變化是改善蛋雞產(chǎn)蛋率重要因素[5]。

近年來，國內(nèi)外學者在當歸芍藥散的現(xiàn)代藥理學研究方面做了大量的工作，闡述當歸芍藥散在治療婦科疾病以及對血管神經(jīng)系統(tǒng)等方面的作用機制[6]，證實了當歸芍藥散具有調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、提高卵巢功能[7]、改善血液流動性和調(diào)節(jié)血液凝固纖溶系統(tǒng)等作用。本研究以實驗室構(gòu)建的重組質(zhì)粒為標準品，β-actin為內(nèi)參基因[8]，通過構(gòu)建實時熒光定量PCR方法，觀察不同濃度當歸芍藥散添加量對OVR基因mRNA的表達水平的影響，探討中藥對蛋雞產(chǎn)蛋性能作用機制，為臨床研究中藥提高產(chǎn)蛋率的分子學機制提供方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

當歸芍藥散：當歸、白芍、茯苓、川芎、澤瀉、白術(shù)，均購自安國市中藥市場，各味藥按處方稱好，粉碎，按1%、1.5%、2%、2.5%、3%的比例與全價配合料混合均勻，干燥放置備用。

試驗動物：39周齡海蘭褐商品蛋雞。

1.2 主要儀器和試劑

TY4133凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）；Rotor-GeneTM6000熒光定量PCR儀(Corbett Research公司)；TGradient溫度梯度PCR儀（Biometra公司）；超微量分光光度計（thermo scientific公司）。 TransZol Up，TransScript First-Strand cDNA合成試劑盒、Easy-Pure Quick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、Trans-Start DNA Polymerase質(zhì)粒提取試劑盒、pEASY-T3 Cloning Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、Trans-Start Green qPCR SuperMix（均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.3 試驗動物與設(shè)計

試驗雞為39周齡海蘭褐商品蛋雞，飼糧預試2周，每天記錄產(chǎn)蛋量、蛋重及耗料量，淘汰不產(chǎn)蛋、精神狀態(tài)差的試驗雞，且體況和產(chǎn)蛋率無顯著差異(P＞0.05)后開始正式試驗。選取288只雞，采用單因子試驗設(shè)計，隨機分為6組，每組4個重復，每重復12羽，第2組至第6組分別飼喂添加1%、1.5%、2%、2.5%、3%中藥試驗飼糧，第1組為空白對照組，試驗期8周。各組飼養(yǎng)管理條件一致，半開放式雞舍，自由采食與飲水，人工補光，機械通風，定期清糞，消毒。

1.4 樣品的采集與制備

試驗第8周末，每組隨機抽取8只雞，無菌、無RNAase下，剖開腹腔，取出排卵前卵泡顆粒層、小黃卵泡（SYF）和大白卵泡（LWF）迅速用已經(jīng)滅菌的鋁箔紙包裹，放于標記好的紗布袋中放液氮速凍，然后至-80℃的超低溫冰箱保存以備測定OVR基因mRNA相對表達量。

1.5 OVR基因mRNA水平的測定

1.5.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中提供的OVR基因的mRNA序列（登錄號GI45382562），運用Oligo 7軟件在基因保守區(qū)域設(shè)計一對引物，上游引物：5′-AGCAAAATGTGAGGAGTCCCAG-3′，下 游 引 物 ：5′-AAGCACTTTCATCACTGCCGTC-3′，目的片段長度為110 bp。內(nèi)參基因選用β-actin基因，上游引物：5′-CTGTGCCCATCTATGAAGGCTA-3′，下 游 引 物：5′-ATTTCTCTCTCGGCT-GTGGTG-3′，序列引物合成由北京全式金生物技術(shù)有限公司完成。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平

1.5.2 RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄

海蘭褐種母雞卵泡總RNA的抽提使用Trizol法提取。cDNA的合成按反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書進行。

1.5.3 引物特異性鑒定標準品的制備

以cDNA為模板，PCR擴增OVR基因，反應(yīng)體系為25 μl：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTPs（10 mmol/l）2 μl，上、下游引物（10 mmol/l）各0.5 μl，Taq酶0.3 μl、cDNA 1 μl，加滅菌雙蒸水補齊至 25 μl。循環(huán)參數(shù)：94℃預變性5 min，94℃變性30 s、61℃退火30 s、72℃延伸30 s（35個循環(huán)），72℃終末延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收目的片段。膠回收的PCR產(chǎn)物與pEASY-T3載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞，用Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit提取重組質(zhì)粒，送北京全式金生物技術(shù)有限公司測序。測序正確的陽性質(zhì)粒作為陽性標準品，參考Giulietti[9]方法計算拷貝數(shù)。

1.5.4 標準品的實時熒光定量PCR

以10倍梯度稀釋好的標準品為模板，在Rotor-GeneTM6000熒光定量PCR儀上擴增并檢測熒光，獲得模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)和臨界循環(huán)數(shù)（Threshold cycle，Ct）的標準曲線和標準方程。

PCR反應(yīng)為12.5 μl體系：TransStartTMGreen Qp-cr SuperMix(2×)10 μl，上、下游引物各0.25 μl(10 μM),稀釋好的標準品模板1 μl，加滅菌雙蒸水補齊至12.5 μl。

反應(yīng)條件：95℃ 5 min；隨后進行40個95℃ 5 s，61℃ 15 s，72℃ 10 s的循環(huán)，4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.6 OVR基因的表達量研究

用以上所建立的實時熒光定量PCR方法檢測不同當歸芍藥散添加量對OVR基因的影響。為了進一步清晰地表示出中藥添加組與正常對照組基因表達之間的關(guān)系，將對照組的基因表達量調(diào)整為1，即用對照組以及中藥添加組的基因表達量除以對照組基因表達量的均值，采用唐中林等（2008）[10]的計算方法根據(jù)標準曲線和Ct值計算基因的相對表達量。結(jié)果采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，方差分析使用One-way anova，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性鑒定

OVR基因的PCR擴增片段在約110 bp處出現(xiàn)1條特異性條帶，擴增片段大小與預期結(jié)果相符(見圖1)，序列經(jīng)克隆、測序分析表明擴增片段為目的片段。

圖1 OVR基因擴增產(chǎn)物

2.2 標準曲線和熔解曲線的分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、克隆、測序后作為標準品，進行10倍系列稀釋，選取1.83×102～1.83×107拷貝/μl 6個稀釋度進行real-time PCR，擴增曲線（見圖2），以Ct值為縱坐標，稀釋倍數(shù)為橫坐標，獲得標準曲線(見圖3)。結(jié)果表明，real-time PCR在1.83×102～1.83×107拷貝/μl反應(yīng)范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 14，擴增效率為102%。熔解曲線分析表明，無引物二聚體和非特異性擴增，產(chǎn)物呈特異的單個峰，其Tm為(82±0.5)℃(見圖4)。

圖2 動力學曲線

圖3 標準曲線

圖4 熔解曲線

2.3 OVR基因的表達研究

表1結(jié)果表明，飼料中添加2%的當歸芍藥散對雞OVR基因的表達量有極顯著影響。

表1 當歸芍藥散對雞OVR基因的表達量的影響

3 討論

在蛋雞繁殖活動中，卵母胞膜表面蛋白OVR數(shù)量是影響卵細胞發(fā)育成熟的重要因素之一[11]，且在雞體內(nèi)，OVR只在卵巢中表達，其他組織幾乎無任何表達[12-13]。OVR是由位于Z染色體上的基因編碼，激素、食物等因素可調(diào)控OVR mRNA的表達量[14-15]，若編碼OVR基因位點發(fā)生突變，即使循環(huán)血量極低密度脂蛋白(VLDL)卵黃生成素(VTG)含量正常，卵母胞因缺乏具有介導細胞內(nèi)吞功能的OVR而不能發(fā)育成熟，導致產(chǎn)蛋能力下降[16]，因此研究卵細胞卵黃生成受體(OVR)調(diào)控基因的表達量，對提高產(chǎn)蛋雞的生產(chǎn)性能尤為重要[17]，本研究采用通過PCR擴增考察調(diào)控OVR基因表達量，分析當歸芍藥散對雞卵泡發(fā)育過程中OVR基因表達量變化。

實時熒光定量PCR按著PCR動力學變化規(guī)律，通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR反應(yīng)進程，并以熒光信號由本底開始進入指數(shù)增長階段的拐點所需要的最少循環(huán)數(shù)(稱為循環(huán)閥值,Ct)建立標準曲線，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析，反映熒光信號與模板濃度對數(shù)間的線性關(guān)系[18]，現(xiàn)已成為定量分析mRNA表達水平最廣泛使用的技術(shù)之一[19]，并在分子診斷、基因表達研究、分子生物學研究、動植物檢疫以及食品安全檢測等方面有廣泛的應(yīng)用[20]。

試驗采集飼喂不同濃度當歸芍藥散的蛋雞卵泡，建立了OVR基因的實時熒光定量PCR方法，結(jié)果顯示，擴增效率為102%，檢測范圍Ct值為10～27，熔解曲線為特異的單峰，檢測范圍間有良好的線性關(guān)系（R2=0.999 14），通過熒光定量PCR檢測添加1%、1.5%、2%、2.5%、3%5個濃度當歸芍藥散的雞卵泡，發(fā)現(xiàn)飼料中當歸芍藥散添加量為2%時，對OVR基因有極顯著影響（P＜0.01）。由此可以看出當歸芍藥散對雞產(chǎn)蛋率有很好調(diào)控作用。

4 結(jié)論

①本研究所建立的SYBR Green I熒光定量PCR特異、快速、準確?？捎糜跍y定雞OVR基因的表達量。

②當歸芍藥散可調(diào)控蛋雞的OVR基因表達，影響蛋雞產(chǎn)蛋率。