■李明華 孟秀梅 徐生林 張貴英 張曉春

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安 223003；2.徐州萬佳牧業(yè)科技發(fā)展有限公司，江蘇徐州 221148）

花生粕是花生仁經(jīng)壓榨提油后的副產(chǎn)物，富含蛋白質(zhì)，適合在禽畜水產(chǎn)飼料中使用?；ㄉ傻臓I養(yǎng)價值較高，粗蛋白含量在38%～47%之間，且含有動物必需的8種氨基酸，屬于完全蛋白[1]。花生蛋白具有良好的功能性質(zhì)和營養(yǎng)特性，其功能性與大豆蛋白接近，卻比大豆蛋白更易吸收，含有的抗?fàn)I養(yǎng)因子比大豆更少，是一種優(yōu)良的飼料加工蛋白質(zhì)原料[2]。但是，國內(nèi)企業(yè)主要通過熱榨和有機(jī)溶劑浸提法提取花生油，提油后得到的花生粕，蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重，營養(yǎng)價值較低。因此，為了充分發(fā)揮花生粕的飼用價值，只有進(jìn)一步處理以提高其在動物體內(nèi)的消化吸收率，才能更好的應(yīng)用這一蛋白質(zhì)資源。

現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)經(jīng)動物消化道中的酶降解后，大多是以寡肽的形式被消化吸收的，以游離氨基酸形式吸收的比例很小，而且寡肽在機(jī)體內(nèi)的吸收、代謝速度也比游離氨基酸快[3]。此外，寡肽除具有調(diào)節(jié)動物腸道菌群、促進(jìn)有益微生物生長繁殖的功效外，還具有促進(jìn)動物生長，提高動物機(jī)體免疫力的作用[4]，這對于降低飼料中抗生素的使用量，降低畜牧產(chǎn)品藥物殘留具有重要的意義。

因此，通過微生物發(fā)酵降解花生粕中的花生蛋白，制備花生肽含量豐富的花生粕飼料，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究將應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化花生粕混菌固態(tài)發(fā)酵的工藝，旨在提高花生粕中花生肽的含量，以提高其在機(jī)體內(nèi)的消化吸收率，同時發(fā)揮一定的功能特性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

熱榨花生粕(山東魯花集團(tuán)有限公司提供)麩皮(購于濟(jì)南市農(nóng)貿(mào)市場)。

1.2 試驗菌株

枯草芽孢桿菌1.0769(購自中國科學(xué)院微生物研究所)、米曲霉3.4383購自中國科學(xué)院微生物研究所。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基

牛肉膏5 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH值7.0，H2O 1 000 ml，121 ℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基加2%的瓊脂粉。

1.3.2 霉菌培養(yǎng)基

取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1 000 ml煮沸30 min，4層紗布過濾，將濾液補足至1 000 ml，加葡萄糖20 g，121℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基加2%的瓊脂粉。

1.3.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基

將花生粕烘干后粉碎至40目，加入10%的麩皮和一定量的純凈水，分裝入250 ml三角瓶，裝量為每瓶50 g，用6層紗布封口，121℃滅菌20 min。

1.4 液體種子的制備

1.4.1 枯草芽孢桿菌種子制備

將活化好的枯草芽孢桿菌菌種從斜面培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接至裝有50 ml細(xì)菌培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，在恒溫?fù)u床中30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)20 h。

1.4.2 米曲霉種子制備

在長滿米曲霉孢子的試管斜面中加入5 ml無菌水，用無菌刮鏟將孢子輕輕刮下，按2%的比例接入裝有50 ml霉菌培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，在恒溫?fù)u床中28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.5 花生粕固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化方法

1.5.1 固態(tài)發(fā)酵方法

將制備的枯草芽孢桿菌和米曲霉種子以總量為10%的比例接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，將培養(yǎng)基置于烘箱中90℃烘干，粉碎至100目后測定花生蛋白的水解度。

1.5.2 單因素試驗

以花生粕中花生蛋白的水解度為指標(biāo)，研究不同菌種比例、培養(yǎng)基含水量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對花生粕中花生蛋白水解度的影響。

1.5.3 響應(yīng)面的組合試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，選取菌種比例、培養(yǎng)基含水量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間四個因素，采用4因素6水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行實驗設(shè)計，優(yōu)化花生粕的發(fā)酵工藝。

1.6 花生蛋白水解度的測定方法[5-6]

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵后的花生粕置于烘箱中90℃烘干，粉碎至100目后，測定樣品中游離氨基氮含量，計算花生蛋白的水解度。

式中：Ah——不同時間發(fā)酵液中的總游離一NH2數(shù)(mmol)；

A0——原料蛋白中固有的游離一NH2數(shù)(mmol)；

A總——原料蛋白強(qiáng)酸水解后的總游離一NH2數(shù)(mmol)。

“是的，我看到很多人為減肥做出的最大努力就是，吃火鍋、吃烤肉、吃蛋糕、吃冰淇淋的時候，配一瓶無糖飲料?！?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 菌種比例對花生蛋白水解度的影響(見圖1)

圖1 菌種比例對花生蛋白水解度的影響

試驗采用枯草芽孢桿菌和米曲霉的不同混合比例為發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，分別采用枯草芽孢桿菌∶黑曲霉為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1和3∶1五個不同的接菌比例進(jìn)行發(fā)酵，其中培養(yǎng)基含水量為50%，發(fā)酵條件為30℃、發(fā)酵時間為96 h。由圖1可以看出，隨著枯草芽孢桿菌接種比例的提高，花生蛋白的水解度逐漸增高，當(dāng)菌種比為1∶1時達(dá)到最高，為34.3%；此后，隨著枯草芽孢桿菌比例的進(jìn)一步增大，水解度逐漸降低。這是因為米曲霉比枯草芽孢桿菌生長繁殖速度慢，降低米曲霉的接種比例后，其蛋白酶的分泌量也相應(yīng)降低，最終影響了花生蛋白的降解。因此，枯草芽孢桿菌∶黑曲霉為1∶1時為混合菌種發(fā)酵的最佳菌種比例。

2.1.2 培養(yǎng)基水分含量對花生蛋白水解度的影響(見圖2)

圖2 水含量對花生蛋白水解度的影響

以兩菌種比例為1∶1的混合菌種接入含水量不同的固體培養(yǎng)基中，30℃發(fā)酵96 h后，比較花生蛋白的水解度。由圖2可得，隨著培養(yǎng)基含水量的逐漸增加，花生蛋白的水解度也逐漸升高，當(dāng)含水量達(dá)到50%時，花生蛋白的水解度基本保持穩(wěn)定，繼續(xù)提高培養(yǎng)基的含水量，水解度變化不大。這是因為酶解反應(yīng)均需在溶液中進(jìn)行，當(dāng)培養(yǎng)基的含水量較低時，蛋白酶和蛋白質(zhì)無法充分接觸，從而影響了花生蛋白的水解。

2.1.3 發(fā)酵溫度對花生蛋白降解的影響(見圖3)

圖3 發(fā)酵溫度對花生蛋白水解度的影響

以兩菌種比例為1∶1的混合菌種接入含水量為50%的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在不同溫度條件下發(fā)酵96 h后，測定花生蛋白的水解度。由圖3可以看出，發(fā)酵溫度低于32℃時，花生蛋白的水解度隨溫度的升高而不斷升高，當(dāng)溫度升至32℃時，花生蛋白的水解度達(dá)到最大值，隨后隨著溫度的進(jìn)一步升高水解度則呈降低趨勢。由此可見，在32℃時，固體培養(yǎng)基中蛋白酶的總活力達(dá)到最高，花生蛋白的水解程度達(dá)到最大，為33.1%。

圖4 發(fā)酵時間對花生蛋白水解度的影響

以兩菌種比例為1∶1的混合菌種接入含水量為50%的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵不同時間后測定花生蛋白的水解度。在發(fā)酵的起始階段，兩菌株迅速生長繁殖，蛋白酶隨之分泌至培養(yǎng)基中，花生蛋白的水解度由此逐漸提高，在發(fā)酵72 h后，菌種產(chǎn)酶的能力大大降低，因此花生蛋白的水解度趨于平緩，基本保持不變，從工業(yè)化生產(chǎn)的角度來看，發(fā)酵72 h比較合理。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果與分析

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，確定出響應(yīng)面試驗方案的因素水平表（見表1）。按照響應(yīng)面試驗方案進(jìn)行試驗，試驗結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計試驗因素水平和編碼

對表2數(shù)據(jù)采用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合，獲得花生蛋白水解度對菌種比例、培養(yǎng)基含水量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的二次多元回歸方程：Y（水解度）=37.95+0.52×A-1.35×B+2.52×C+1.50×D+2.48×A×B-0.12×A×C+0.078×A×D+3.67×B×C+0.85×B×D-1.77×C×D-1.63×A2-3.26×B2-3.42×C2-0.87×D2。

從表 3回歸模型分析結(jié)果可以看出，模型 P=0.000 2＜0.01，表明該回歸模型達(dá)到了極顯著水平，說明該模型是有意義的。模型失擬項P=0.0744＞0.05，表明失擬項不顯著，模型預(yù)測值與實際值擬合較好。該模型的，變異系數(shù)為 5.25，說明模型擬合程度比較好，試驗誤差小，可用該模型分析和預(yù)測不同發(fā)酵條件下花生蛋白的水解度。由回歸分析結(jié)果還可得知，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對花生水解度的影響大小排序順序為：發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞培養(yǎng)基含水量＞菌種比例；方程中C、BC、B2、C2對花生蛋白水解度的影響極顯著，B、D、AB、A2對花生蛋白水解度的影響顯著，這表明各個影響因素與響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，二次項和交互項對花生蛋白的水解度也有影響。

表2 Box-Behnken設(shè)計方案及響應(yīng)值結(jié)果

表3 二次回歸模型方差分析結(jié)果

2.2.2 發(fā)酵條件的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

在響應(yīng)面圖中，可根據(jù)等高線的形狀判斷各因素交互作用的強(qiáng)弱，等高線為橢圓形時兩因素交互作用顯著、各等高線排列越密集，表明因素的變化對結(jié)果影響越大；等高線為圓形時，兩因素的交互作用較小[7-8]。根據(jù)本試驗回歸分析結(jié)果，做出相應(yīng)的等高線和相應(yīng)曲面圖，如圖5～圖10所示。其中，圖5和圖8響應(yīng)面圖的等高線比較密集，說明菌種比例與培養(yǎng)基含水量(AB)、培養(yǎng)基含水量與發(fā)酵溫度(BC)的交互作用對花生蛋白的水解度具有顯著的影響；此外，圖5～圖10中的各個響應(yīng)曲面均為凸面，表示該模型在試驗范圍內(nèi)存在穩(wěn)定點，且穩(wěn)定點為最大值。

2.2.3 驗證試驗

圖5 菌種比例和培養(yǎng)基含水量對花生蛋白水解度的影響

圖6 菌種比例和發(fā)酵溫度對花生蛋白水解度的影響

圖7 菌種比例和發(fā)酵時間對花生蛋白水解度的影響

圖8 培養(yǎng)基含水量和發(fā)酵溫度對花生蛋白水解度的影響

由軟件自動分析可得，當(dāng)枯草芽孢桿菌與米曲霉接種比例為1.45，培養(yǎng)基的含水量為51.25%，發(fā)酵溫度為33.03℃，發(fā)酵時間為88.11 h時，花生粕中花生蛋白的水解度最大，達(dá)到38.76%。為方便實際操作，選取接種比例為1.5，培養(yǎng)基含水量為50%，發(fā)酵溫度為33℃，發(fā)酵時間為88 h，在此條件下驗證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性。驗證結(jié)果表明，3個平行試驗的平均值為38.32%，與理論預(yù)測值相符，證明本研究方法對混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)花生肽飼料的條件優(yōu)化是可行和準(zhǔn)確的。

圖9 培養(yǎng)基含水量和發(fā)酵時間對花生蛋白水解度的影響

圖10 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對花生蛋白水解度的影響

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)花生粕多肽飼料的條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了菌種接種比例、花生粕含水量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間四個因素的二次多項式回歸模型，經(jīng)驗證試驗證明該模型是合理可靠的。由該模型得到的優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)為：枯草芽孢桿菌與米曲霉菌種比例為3∶2，花生粕含水量為50%，發(fā)酵溫度為33℃，發(fā)酵時間為88 h，在此條件下，花生粕中花生蛋白的水解度為38.32%，與理論值基本相符。因此，利用響應(yīng)面分析方法對花生粕固態(tài)發(fā)酵制備花生粕多肽飼料的條件進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，這為進(jìn)一步的試驗研究鑒定基礎(chǔ)。