丁 然，王啟寶

(1.中國礦業(yè)大學(xué)(北京)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京100083;2.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京100190)

隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多的生物大分子如蛋白質(zhì)和多肽等需要進行分析、分離和純化［1］。常用的傳統(tǒng)生物大分子分離方法有沉淀、透析、超濾和溶劑萃取等。它們都是一些較早就建立起來的分離方法，至今仍然被廣泛應(yīng)用［2］。

1903年俄國植物學(xué)家Tswett，在一填有碳酸鈣的玻璃柱中注入用石油醚萃取的植物色素，在室溫下展層，得到不同的色素區(qū)帶，后來稱之為色譜［3］。開始時，色譜技術(shù)并未得到廣泛關(guān)注，直至20世紀(jì)60年代，由于開發(fā)出適用于生物物質(zhì)分離純化的層析固定相，層析技術(shù)才被用于生物物質(zhì)的分離純化并得到迅速發(fā)展［4］。至今，已有豐富的色譜技術(shù)被用于生物大分子的分離。填充在層析柱內(nèi)的多孔分離介質(zhì)在分離過程中起到關(guān)鍵作用，是決定生物分子的活性、收率和成本的關(guān)鍵因素。一般的合成多孔介質(zhì)是利用交聯(lián)聚合物和液體的貧溶劑或非溶劑(稱為稀釋劑或致孔劑)之間的相分離而形成孔道，這種機理必然造成孔徑是在納米級(10～30 nm)。由于孔徑較小，流動相在孔道內(nèi)的傳質(zhì)過程主要依靠分子擴散完成，導(dǎo)致生物大分子的傳質(zhì)速度慢、分離時間長［5］。為了克服傳質(zhì)緩慢問題，研究人員提出了超大孔灌注色譜介質(zhì)的定義。這種介質(zhì)由于擁有貫穿孔和擴散孔結(jié)構(gòu)，增強了顆粒的可滲透性［6］，應(yīng)用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分離純化中，顯示了分離速度快，柱容量高和產(chǎn)率高的優(yōu)點［7－8］。商品化的 poros灌注色譜介質(zhì)是采用納米級顆粒粘結(jié)成簇聚集成團，進而形成微米級顆粒的方法來制備的，因此，通過控制納米顆粒間的不規(guī)則聚集狀態(tài)來控制孔徑比較困難，造成產(chǎn)品批次間重復(fù)性差，收率低等問題，致使poros介質(zhì)的應(yīng)用停止不前［9］。

針對這一問題，本實驗室開發(fā)了一種新型制備超大孔微球方法－表面活性劑反膠團溶脹法，已成功制備出超大孔聚苯乙烯微球(Polystyrene，PST)和超大孔甲基丙烯酸縮水甘油酯聚合物微球［Poly(glycidylmethaerylate)，PGMA］，孔徑可達500 nm以上［10－11］。.這種制備方法與常規(guī)懸浮聚合類似，區(qū)別在于油相內(nèi)加入較高含量的表面活性劑，表面活性劑在油相內(nèi)形成大量反膠團聚集體，油相分散到水相中后，油相液滴內(nèi)的反膠團可自發(fā)從外水相中吸水溶脹，此時液滴形成的是水/表/油的乳液，聚合后，水合聚合物的相分離進一步增強，水相形成大孔。

聚苯乙烯微球表面的強疏水性限制了它在生物大分子分離方面的應(yīng)用［12］，常規(guī)方法是用多糖進行物理吸附或化學(xué)交聯(lián)對微球表面進行修飾，但是這種方法很不穩(wěn)定易脫落。本研究用兩親性葡聚糖替代原聚合體系中的油相表面活性劑Span80制備超大孔聚苯乙烯微球，用電導(dǎo)率儀和冷場掃描電鏡考察了油溶性表面活性劑在反應(yīng)體系中對聚合物微球孔結(jié)構(gòu)的影響規(guī)律，繪制了雙連續(xù)相乳液三相圖，從機理分析體系復(fù)乳液的形成過程。

1 實驗

1.1 實驗材料

苯乙烯(ST，北京化學(xué)試劑公司)為單體，化學(xué)純;聚乙烯醇［Poly(vinyl alcohol)，PVA －217，聚合度1700，水解度88.5%，由東京化工株式會社提供］用作水相;交聯(lián)劑二乙烯基苯(DVB，北京化學(xué)試劑公司)為工業(yè)純;過氧化苯甲酰(Benzoyl Peroxide，BPO，北京化學(xué)試劑公司，含水量25%)用作聚合引發(fā)劑，分析純;十六烷(Hexadecane，HD，Wako Pure Chemical Industries，Japan)為疏水性稀釋劑，阻止單體擴散到水相，為分析純;Span80(北京邦德科技貿(mào)易公司)起到穩(wěn)定界面的作用，化學(xué)純;葡聚糖(Dextran，北京華力德科技有限公司，分子量5000)為親水基團;甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA，F(xiàn)luka，北京化學(xué)試劑公司)為疏水基團，化學(xué)純;二甲基亞砜，4－二甲基氨基吡啶(DAMP)，無水硫酸鈉，無水乙醇，丙酮等均購于北京化學(xué)試劑公司。

1.2 微球制備

在燒杯中加入一定配比的單體、交聯(lián)劑、稀釋劑、表面活性劑和引發(fā)劑(BPO)，配成油相，攪拌至BPO完全溶解.將一定量穩(wěn)定劑(PVA)、無水硫酸鈉溶解于去離子水中配成水相，在攪拌(300 r/min)條件下將油相分散于水相制成O/W乳液。常溫反應(yīng)1 h后，將溫度升至65℃，65℃反應(yīng)1 h，升溫至75℃，75℃反應(yīng)2 h，升溫至85℃，85℃反應(yīng)6 h。所得聚合物微球分別用水和乙醇清洗數(shù)次。微球內(nèi)未聚合的物質(zhì)如表面活性劑、稀釋劑等再用丙酮去除。室溫真空干燥后，即得成品。

1.3 兩親性葡聚糖制備

稱量20.0 g相對分子質(zhì)量為5000的葡聚糖，100 mL二甲基亞砜，20 mL GMA，3.2 g 4－二甲基氨基吡啶(16%)，20 g葡聚糖和3.2 g 4－二甲基氨基吡啶磁力攪拌溶解于二甲基亞砜，再將溶液置于三口燒瓶，在燒瓶中加入20 mL GMA，攪拌進行水浴，槳轉(zhuǎn)速 160 r/min，水浴溫度37℃，反應(yīng)72 h。

1.4 雙連續(xù)相微乳液電導(dǎo)率的測定

在容量15 ml的小燒杯中加入4.5 g苯乙烯、1.5 g DVB、0.6 g十六烷、0.45 g BPO和一定比例的Span80，燒杯置于磁力攪拌器上，在攪拌的過程中每滴加0.1 mL兩親性葡聚糖水溶液(葡聚糖水溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%)即測定一次溶液的電導(dǎo)率值，觀察讀數(shù)變化并繪制電導(dǎo)率曲線。

1.5 雙連續(xù)相微乳液三相圖的繪制

取一潔凈的試管將單體和水按照 1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 的比例加入試管中，加入按比例配置好的乳化劑(葡聚糖－GMA水溶液)和助乳化劑(SDS)的混合物，通過目視觀察體系的相轉(zhuǎn)變點，初步確定相界限［相轉(zhuǎn)變點見圖3］。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 雙連續(xù)相乳液電導(dǎo)率測定結(jié)果

圖1為不同含量Span80的雙連續(xù)相乳液體系的電導(dǎo)率曲線，Span80在該體系中起到穩(wěn)定界面的作用，表面活性劑是兩親性葡聚糖。從圖可見，Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對電導(dǎo)率曲線的趨勢有著顯著影響。當(dāng)Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，5%和10%時，由于含量過低，故不能起到穩(wěn)定界面的作用，乳液分層現(xiàn)象嚴(yán)重，電導(dǎo)率曲線的規(guī)律性也比較差，這與前期實驗所制備的微球從電鏡圖片上觀察到的現(xiàn)象是一致的。而當(dāng)Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到20%以上時，其濃度能夠起到穩(wěn)定界面的作用，電導(dǎo)率也呈現(xiàn)出規(guī)律性，40%的曲線電導(dǎo)率值出現(xiàn)了急劇增大的區(qū)域，20%，30%和50%的曲線電導(dǎo)率值則均平緩上升。通過電導(dǎo)率－吸水量曲線的測定研究了表面活性劑用量對油包水微乳液結(jié)構(gòu)的影響，確定了乳液由小液滴相互碰撞、隨吸水量增大形成雙連續(xù)結(jié)構(gòu)的過程，連續(xù)水通道的大小和數(shù)量主要由表面活性劑用量決定。隨兩親性葡聚糖用量增加，反膠團數(shù)增多，進而從外水相吸收的水分增多，形成的孔道也會增大。

2.2 表面活性劑含量對微球孔結(jié)構(gòu)的影響

分別選取 Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù) 20%，30%和40%電導(dǎo)率曲線的轉(zhuǎn)折點制備聚合物微球，如圖2。20%的情況由于Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍然偏低，體系不夠穩(wěn)定，所以造成球表面不均勻，球形比較圓，但是孔道很小。30%的微球孔道較20%的略大，可能是由于span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)增高的原因，微球表面也明顯均勻，但是孔道仍與我們的預(yù)期有差距。當(dāng)Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%時，制備出的微球孔道比較理想，但是由于Span80含量較高已經(jīng)能夠替代兩親性葡聚糖起到表面活性劑的作用，所以修飾上的親水基含量較低。

圖2 Span80用量對微球形貌和孔徑的影響

2.3 雙連續(xù)相乳液三相圖

從三相圖中筆者分析由于葡聚糖相對分子質(zhì)量(5000)比較大，所以很難高濃度的加入到體系中，這給我們的啟示是需要尋求一種分子量比較小的糖類來替代現(xiàn)有的葡聚糖進行新的嘗試。

圖3 表面活性劑為兩親性葡聚糖水溶液體系的三元相圖

3 結(jié)論

利用表面活性劑反膠團溶脹法合成了不同孔徑的PST共聚物微球，考察了Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對復(fù)乳液體系穩(wěn)定性和微球孔結(jié)構(gòu)的影響，得出如下結(jié)論:

(1)油相表面活性劑Span80用量對微球大孔徑有很重要的影響，與微球孔徑呈正相關(guān)。Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)在40%時，微球孔徑與理想情況最為接近。

(2)油相表面活性劑Span80用量對聚合體系穩(wěn)定性有很重要的影響，Span80質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，體系越穩(wěn)定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%以上時電導(dǎo)率曲線呈現(xiàn)規(guī)律性。

(3)葡聚糖分子量比較大，很難高濃度的加入聚合體系內(nèi)，這應(yīng)該是微球親水性不能得到良好改善的原因之一。

［1］李燕，周煒清，馬光輝.超大孔聚(苯乙烯－甲基丙烯酸縮水甘油酯)共聚微球的制備及結(jié)構(gòu)的調(diào)控［J］.過程工程學(xué)報，2010，10(3):608 －612.

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