陳 媛，虞立霞，洪 燕△，牛 超，高婧瑋，金 宏，汪雪蘭，汪 ?！?/p>

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津300050；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510080）

在高原環(huán)境中，低氧是主要的刺激因子，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是對(duì)缺氧最為敏感的系統(tǒng)［1］。目前，有大量研究表明高原環(huán)境對(duì)人的認(rèn)知功能如短時(shí)記憶、注意廣度、思維判斷能力等產(chǎn)生明顯影響［2］。急性低氧暴露后海馬、皮質(zhì)和紋狀體神經(jīng)元的凋亡可能導(dǎo)致動(dòng)物空間記憶能力的下降，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷［3］，有研究發(fā)現(xiàn)在模擬海拔4 000 m低氧暴露1 d后大鼠腦中小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變［4］，而關(guān)于慢性低氧對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力及行為能力的影響報(bào)道較少，對(duì)其機(jī)制的研究尚處于探索階段。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M高原海拔5 500 m的環(huán)境，檢測(cè)不同低氧時(shí)間對(duì)小鼠認(rèn)知能力和活動(dòng)能力的影響及神經(jīng)元重要結(jié)構(gòu)蛋白tau蛋白磷酸化程度的改變，以期探討低氧導(dǎo)致認(rèn)知功能改變的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取成年雄性昆明小鼠45只，32～35 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心提供。在普通動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，剔除體重過(guò)輕或過(guò)重的小鼠。室溫維持在24～27℃，濕度為50%～65%，自由攝食，自然光照。

1.2 高原低氧模型

將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成 4組（n＝10）：對(duì)照組（Control）、8 h低氧暴露組（8 h）、7 d低氧暴露組（7 d）、28 d低氧暴露組（28 d）。將低氧暴露組動(dòng)物置于低壓艙內(nèi)，模擬海拔高度為5 500 m（380 mmHg），勻速升至固定高度后保持8 h，期間自由攝食。對(duì)照組置于另一動(dòng)物艙內(nèi)，但不低氧，溫濕度與低氧組基本一致。從第1天開(kāi)始每隔4 d在上艙前稱體重，記錄體重?cái)?shù)據(jù)。下倉(cāng)后立即對(duì)每組動(dòng)物進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)和蛋白免疫印跡檢測(cè)，避免常氧環(huán)境對(duì)其影響。

1.3 蛋白免疫印跡

將小鼠處死后，冰上取腦，分離出海馬、皮層，加入RIPA裂解液，冰上裂解，靜置45 min后于 4℃10 000 r／min離心10 min，取上清，蛋白定量后加入上樣緩沖液煮沸5 min。用聚丙烯酰胺凝膠電泳，在電壓100 V的條件下電泳2 h。電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore），電壓80 V，1 h。2%BSA室溫封閉 1 h，加入一抗，4℃過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光液顯色。

實(shí)驗(yàn)中所用一抗兔源抗鼠pS396、pT181、pS262購(gòu)自Abcam，鼠源抗鼠 tau46、兔源抗鼠 tubulin購(gòu)自Santacruz，鼠源抗鼠 AT8（pS202／T205）購(gòu)自 Pierce。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗或羊源抗兔二抗購(gòu)自 Sigma公司，ECL（enhanced chemiluminescent）試劑盒從Advansta公司購(gòu)買(mǎi)。

1.4 避暗實(shí)驗(yàn)

避暗箱（購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，型號(hào)：SBA-2小鼠避暗程序自動(dòng)控制儀）由兩個(gè)測(cè)試箱組成，分為明室和暗室兩部分。暗室可獨(dú)立通電，底部銅柵通36 V、50 Hz交流電。測(cè)試時(shí)將鼠背對(duì)洞口放入明室，小鼠進(jìn)入暗室則受到電擊，避暗儀自動(dòng)記錄5 min內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)，即為錯(cuò)誤次數(shù)，記錄首次進(jìn)入暗室的時(shí)間，即為避暗潛伏期。避暗箱實(shí)驗(yàn)步驟（1）適應(yīng)環(huán)境：第1天將各組小鼠從明室放入測(cè)試箱中，令其在不通電的情況下自由穿梭，適應(yīng)環(huán)境5 min，然后取出。第2天向暗室底部銅柵通36 V，50 Hz交流電，再將小鼠背對(duì)洞口放入明室，小鼠進(jìn)入暗室則受到電擊，電擊1次即拿出。（2）測(cè)試：第3天在同一時(shí)間重復(fù)前一天實(shí)驗(yàn)，將暗室通電，小鼠放于明室，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)自動(dòng)記錄第1次進(jìn)入暗室的時(shí)間（潛伏期）和5 min內(nèi)受到的電擊次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)）。若小鼠5 min未進(jìn)入暗室，錯(cuò)誤次數(shù)記為0次，潛伏期記為300 s。

1.5 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)箱為100 cmⅹ100 cmⅹ100 cm的黑色箱體，底面有25個(gè)方格（20 cmⅹ20 cm），上面敞開(kāi)，中央?yún)^(qū)域?yàn)?個(gè)方格。將小鼠置于曠場(chǎng)箱中央?yún)^(qū)域，開(kāi)始計(jì)時(shí)，記錄小鼠前肢跨出中央?yún)^(qū)域的時(shí)間，記為潛伏期。觀察記錄其橫穿的格子數(shù)和直立次數(shù)，當(dāng)其身體直立雙臂離開(kāi)地面1 cm算為一次。5 min后停止實(shí)驗(yàn)，將小鼠拿出，用酒精擦拭曠場(chǎng)箱揮干后，進(jìn)行下一只小鼠的實(shí)驗(yàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 低氧不同時(shí)間小鼠體重變化

實(shí)驗(yàn)前各組小鼠體重?zé)o差異，低氧處理的前兩周低氧組小鼠體重增長(zhǎng)速度與對(duì)照組相比較慢，28 d低氧暴露后接近對(duì)照，說(shuō)明對(duì)照組與低氧組之間小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育未見(jiàn)明顯差異。

Fig.1 Trend of body weight variations of control and hypobaric hypoxia（HH）groups（ˉx±s，n＝10）

2.2 不同低氧時(shí)間對(duì)小鼠短期記憶力的影響

急性低氧8 h后，小鼠避暗潛伏期有所下降，連續(xù)低氧28 d后顯著降低（P＜0.05），錯(cuò)誤次數(shù)隨著低氧時(shí)間的增加而增多（P＜0.05）。說(shuō)明急性低氧對(duì)小鼠的短期學(xué)習(xí)記憶能力有損傷，慢性低氧較急性低氧嚴(yán)重（表1）。

2.3 不同低氧時(shí)間對(duì)小鼠行為能力的影響

8 h低氧暴露后穿格數(shù)和直立次數(shù)呈降低趨勢(shì)，7 d后略有升高，但均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。28 d低氧暴露后在中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），穿格數(shù)和直立次數(shù)顯著降低（P＜0.05，表2）。*

Tab.1 Effects of hypoxia on the latency period and number of mistakes in passive avoidance test（ˉx±s，n＝10）

Tab.2 Effect of hypoxia on the exploratory and locomotors activity in open field test（ˉx±s，n＝10）

2.4 不同低氧時(shí)間對(duì)tau蛋白磷酸化的影響

在海馬組織中，隨著低氧暴露時(shí)間的增加tau蛋白Thr181、Ser202／T205和Ser396位點(diǎn)的磷酸化程度有上升趨勢(shì)，Thr181、Ser202／T205在 28 d低氧暴露后顯著升高分別為 0.91±0.11、0.53±0.05（P＜0.05）；低氧暴露 8 h、7 d時(shí)，Ser262磷酸化程度未發(fā)生明顯改變，而28 d后其磷酸化程度明顯升高到0.86±0.09（P＜0.05），為常氧環(huán)境的 3倍。皮層中的磷酸化Thr181、Ser262含量在低氧暴露7 d后達(dá)到最高，分別為 0.45±0.07、0.66±0.08（P＜0.05），28 d后略有下降（P＜0.05）；Ser202／T205位點(diǎn)的磷酸化水平隨著低氧暴露時(shí)間增加而升高，在28 d時(shí)達(dá)到最高為 0.51±0.04（P＜0.05，圖 3）。

Fig.3 Influence of hypoxia on the expression of phosphorylated tau in cortex and hippocampus

3 討論

低壓低氧引起腦損傷及功能障礙目前已得到證實(shí)。有研究發(fā)現(xiàn)急性低氧暴露可增加腦血管微循環(huán)障礙［5］，也有研究顯示急性低壓低氧環(huán)境導(dǎo)致的空間記憶下降與腦水腫及氧化應(yīng)激系統(tǒng)失衡有關(guān)［6］。此前的研究主要集中在急性低氧造成的血管損傷，關(guān)于亞急性、慢性低氧對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)影響的相關(guān)報(bào)道較少，其具體機(jī)制也尚未完全明了。本研究通過(guò)避暗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模擬海拔5 500 m不同低氧暴露對(duì)小鼠被動(dòng)逃避能力的影響，28 d低氧暴露后小鼠的避暗潛伏期與對(duì)照組相比明顯縮短，平均錯(cuò)誤次數(shù)增加，提示慢性間歇性低壓低氧會(huì)對(duì)其短期記憶能力造成損害。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著低氧時(shí)間增加，小鼠在中央?yún)^(qū)域的活動(dòng)時(shí)間增加，穿格、直立次數(shù)降低，說(shuō)明28 d低氧暴露后小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)，興奮性降低，導(dǎo)致小鼠的自發(fā)活動(dòng)能力下降。

tau蛋白作為神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要支撐作用的結(jié)構(gòu)蛋白，參與細(xì)胞骨架的形成，與微管結(jié)合后協(xié)助微管正確組裝，并維持其穩(wěn)定，當(dāng)其發(fā)生過(guò)度磷酸化將可能形成神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元退行性病變及其功能障礙，影響認(rèn)知能力［7］。目前已發(fā)現(xiàn)的 tau蛋白絲／蘇氨酸位點(diǎn)有79個(gè)，在促進(jìn)和穩(wěn)定微管結(jié)合能力方面作用比較大的有30多個(gè)［8］，本研究選取的位點(diǎn)分別位于脯氨酸富含區(qū)、重復(fù)序列區(qū)域和羧基端區(qū)域。Western blot結(jié)果顯示tau蛋白上多個(gè)位點(diǎn)的磷酸化程度隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)而加劇，低氧可引起tau蛋白的多 個(gè) 絲／蘇 氨 酸 位 點(diǎn) （Thr181、Ser262、Ser202／Thr205、Ser396）發(fā)生過(guò)度磷酸化。在海馬組織中，與常氧環(huán)境相比，Ser262、Thr181、Ser202／Thr205和Ser396位點(diǎn)的磷酸化程度在28 d低氧暴露后均顯著升高，其中Ser262位于tau蛋白分子的重復(fù)序列區(qū)域，屬于微管結(jié)合區(qū)，過(guò)度磷酸化會(huì)導(dǎo)致tau蛋白從微管上解離，使微管解聚，減弱tau的微管結(jié)合能力［9］。Thr181、Ser202／Thr205是脯氨酸富含區(qū)的重要位點(diǎn)，過(guò)度磷酸化后會(huì)促進(jìn)tau寡聚化，從而加劇神經(jīng)退行性形變的進(jìn)程［10］。Ser396位點(diǎn)位于tau的羧基端，這個(gè)位點(diǎn)的磷酸化對(duì)其形成神經(jīng)纖維纏結(jié)起關(guān)鍵作用［11］。與海馬組織中的tau蛋白磷酸化變化趨勢(shì)不同的是，皮層組織中的tau蛋白磷酸化程度在低氧7 d達(dá)到最高，28 d后略有下降，其原因可能是皮層所在的大腦邊緣區(qū)域是對(duì)低氧最敏感的腦區(qū)［12］，低氧刺激能導(dǎo)致其在較短時(shí)間發(fā)生分子水平的改變。而海馬是與學(xué)習(xí)記憶最為相關(guān)的結(jié)構(gòu)，慢性低氧對(duì)其造成損傷的過(guò)程較慢，這也能夠從慢性低氧導(dǎo)致動(dòng)物認(rèn)知能力和行為活動(dòng)能力降低體現(xiàn)出來(lái)。說(shuō)明低壓低氧刺激使海馬和皮層組織中的tau蛋白修飾發(fā)生改變，導(dǎo)致神經(jīng)元產(chǎn)生病理性變化，進(jìn)而影響小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

本研究結(jié)果提示tau蛋白過(guò)度磷酸化可能是低氧引起小鼠記憶衰退的分子機(jī)制之一，并為深入開(kāi)展相關(guān)分子機(jī)制研究提供參考。

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