趙宇 綜述 楊燕張凱審校

作者單位：233004 安徽蚌埠 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1腫瘤內(nèi)科，2口腔科；蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生部

綜述

縫隙連接細(xì)胞間通訊與肝細(xì)胞癌關(guān)系的研究進(jìn)展

趙宇 綜述 楊燕1張凱2審校

作者單位：233004 安徽蚌埠 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1腫瘤內(nèi)科，2口腔科；蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生部

縫隙連接（gap junction，GJ）是相鄰細(xì)胞之間由縫隙連接蛋白（connexin，Cx）組成的一種特殊膜結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)通過GJ在相鄰細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)和能量的直接交換現(xiàn)象稱為縫隙連接細(xì)胞間通訊（gap junctional intercellular communication，GJIC）。研究證明GJIC功能的異常與腫瘤，包括肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。本文擬對GJIC與HCC的關(guān)系，以及GJIC作為HCC治療新靶點(diǎn)的潛在價值作一綜述。

肝腫瘤；縫隙連接蛋白；縫隙連接細(xì)胞間通訊；治療靶點(diǎn)

原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，其中90%以上是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。全球癌癥發(fā)病率中，HCC居于第6位，死亡高居第3位［1］。我國是全球HCC發(fā)病和死亡人數(shù)最多的國家，且呈逐年上升趨勢［2］。攻克HCC成為亟待解決的重大課題之一，然而HCC的發(fā)病機(jī)制迄今仍未明了。近年來，縫隙連接（gap junction，GJ）結(jié)構(gòu)和功能的研究為探索多種腫瘤和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的發(fā)生機(jī)制提供了新思路。GJ是位于兩個相鄰細(xì)胞之間的一種蛋白質(zhì)連接通道，由特殊的通道蛋白——縫隙連接蛋白（connexin，Cx）組成，主要功能是直接介導(dǎo)相鄰細(xì)胞之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而對細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等生理過程起重要的調(diào)控作用，該過程稱為縫隙連接細(xì)胞間通訊（gap junctional intercellular communication，GJIC）。研究表明，GJIC正常功能的維持能抑制多種腫瘤包括HCC的發(fā)生［3，4］。正常肝細(xì)胞間GJIC功能旺盛，但癌變后顯著下調(diào)，原因可能為Cx表達(dá)減弱、缺失或Cx的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)異位表達(dá)［5］。相反，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞間GJIC的功能，在一定程度上能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的惡性程度［6］。現(xiàn)今認(rèn)為Cx基因異常表達(dá)所致的GJIC功能缺陷可能是HCC發(fā)生的重要機(jī)制之一。本文對近年來GJIC與HCC關(guān)系的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，試圖從GJ介導(dǎo)的信號通路異常理論，為探討HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制及提高療效提供新思路。

1 GJIC的形成

Cx是多基因家族編碼的一類結(jié)構(gòu)相似而分子量不同的蛋白質(zhì)，目前在人類共發(fā)現(xiàn)有21種，分別以其分子量大小命名，如Cx26、Cx32和Cx43等。在細(xì)胞膜上，每6個形狀相同、功能一致的啞鈴形Cx蛋白環(huán)繞中央孔道排列聚集形成連接子（connexon），即半通道（hemichannel）。兩相鄰細(xì)胞半通道端對端錨接（docking）形成直徑約1.5nm的完整蛋白質(zhì)通道——GJ。當(dāng)GJ通道開放時，允許離子（如Na＋、K＋、Ca2＋等）及其他相對分子質(zhì)量＜1 kDa的小分子物質(zhì)（如第二信使cAMP、cGMP、IP3等參與細(xì)胞生長分化的調(diào)節(jié)物質(zhì)）通過。不同物質(zhì)通過GJ通道在相鄰細(xì)胞間流動以進(jìn)行信息和能量的交換現(xiàn)象稱為GJIC。GJIC是不耗能的被動擴(kuò)散過程并參與多種生物學(xué)事件的發(fā)生，其中重要的生物學(xué)功能包括：⑴信號傳遞功能。細(xì)胞通過GJIC交換細(xì)胞間的離子信號和其他調(diào)節(jié)信號。如當(dāng)細(xì)胞受到某種刺激或外界信息時，其離子電位發(fā)生變化，該離子或調(diào)節(jié)信號通過GJ迅速傳遞至相鄰細(xì)胞，使之也在短時間內(nèi)對信號反應(yīng)，從而完成機(jī)體的整體功能。⑵緩沖某些化學(xué)物質(zhì)的毒性作用。當(dāng)細(xì)胞受到某些毒性化學(xué)物質(zhì)損害時，可通過一系列GJ通道向周圍細(xì)胞排出毒物，稀釋該細(xì)胞的毒物濃度，減少毒物對細(xì)胞的損害。⑶通過周圍細(xì)胞滋養(yǎng)受損細(xì)胞。如上所述，當(dāng)某個細(xì)胞受損害時，GJIC不僅可向周圍正常細(xì)胞傳導(dǎo)損傷帶來的效應(yīng)，也可以經(jīng)周圍細(xì)胞向受損細(xì)胞提供所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，協(xié)助恢復(fù)功能。當(dāng)然如果細(xì)胞受損嚴(yán)重或毒物濃度過高，GJ通道關(guān)閉，可致該細(xì)胞死亡而避免毒物擴(kuò)散。⑷參與組織的局部代謝。組織GJIC功能良好時，局部組織的代謝物質(zhì)經(jīng)GJIC調(diào)節(jié)作用可得到適當(dāng)?shù)胤峙?，使代謝物質(zhì)均勻分布于相鄰不同的細(xì)胞。此外，通過GJIC的分配作用，一些功能缺陷的細(xì)胞也可得到功能恢復(fù)和擴(kuò)增的機(jī)會。由此可見，GJIC是細(xì)胞生物學(xué)行為的重要調(diào)控方式，在細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等多種生理過程中發(fā)揮重要作用［7］。

2 GJIC功能異常在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用

惡性腫瘤（包括HCC）的發(fā)生及轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段的復(fù)雜過程，首先是機(jī)體在一系列致癌因素作用下部分“自由”細(xì)胞無控性增殖惡變，然后該惡變細(xì)胞從原發(fā)瘤脫落并侵入到基質(zhì)，進(jìn)入血管或淋巴管，再隨血流運(yùn)行到靶器官的終末性血管并與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性地黏附，最后穿過基膜在靶器官組織克隆性生長。在這個過程中，GJIC功能的異常發(fā)揮重要作用。正常水平的GJIC能夠增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞之間的結(jié)合力，使細(xì)胞不易脫落。GJIC對細(xì)胞的生長、增殖等生物學(xué)行為起調(diào)控作用。在腫瘤形成的早期階段，某些癌基因如neu、ras、c-myc等的異常表達(dá)或抑癌基因p53的低表達(dá)都可降低GJIC［8］，GJIC功能下降可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞之間失去正常的調(diào)控信息，同時使密度依賴性生長抑制作用喪失并失去器官整體控制作用。腫瘤細(xì)胞的失控性生長引起局部張力增加，容易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的脫落并向張力低的基質(zhì)間隙侵襲。而腫瘤細(xì)胞GJIC功能的下調(diào)或缺失，可能造成腫瘤特異性抗原提呈缺損或免疫細(xì)胞不能識別腫瘤細(xì)胞；也可能由于不能向免疫細(xì)胞傳遞cAMP、蛋白激酶、IP3等信息物質(zhì)，免疫細(xì)胞不被激活，致使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷而在循環(huán)中生存下來，繼而運(yùn)行到靶器官。最后腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附后建立起異源性GJIC。如腫瘤細(xì)胞可通過GJIC向血管內(nèi)皮細(xì)胞傳送某種信號物質(zhì)（如花生四烯酸的代謝產(chǎn)物12（s）-HETE），使血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮并釋放蛋白水解酶，進(jìn)而引起基質(zhì)的溶解和破壞，促使腫瘤細(xì)胞穿過內(nèi)皮細(xì)胞層及基質(zhì)，最后進(jìn)入繼發(fā)部位克隆性生長。細(xì)胞內(nèi)存在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和方式，且有交叉調(diào)控的特點(diǎn)。細(xì)胞間通訊可調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也可反向影響細(xì)胞的通訊過程?？梢奊JIC并非孤立地影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展，而是與其他因素相互協(xié)調(diào)、影響，共同構(gòu)成控制腫瘤生長的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。

3 GJIC在正常肝臟組織中的形成及功能

在正常肝臟組織中，主要存在Cx26、Cx32、Cx43基因的表達(dá)［9］。其中Cx32均勻分布于肝細(xì)胞中，形成肝臟GJ的90%。Cx26次之，主要分布于門靜脈周圍。Cx43只在肝臟內(nèi)皮細(xì)胞、膽管內(nèi)皮細(xì)胞和庫否氏細(xì)胞中表達(dá)，但不出現(xiàn)在正常的肝細(xì)胞中。這些Cxs共同組成肝細(xì)胞物質(zhì)傳遞和信息通訊功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，維持正常肝細(xì)胞的GJIC，在協(xié)調(diào)肝臟組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞分化及生長控制過程中起著重要的作用。研究表明，多種外來的或內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)可通過不同的機(jī)制影響肝細(xì)胞Cx的表達(dá)及其組成的GJIC水平［10，11］。而肝臟中Cx結(jié)構(gòu)功能的變化，可以改變GJ通道的通透性和對通透物質(zhì)的選擇性，進(jìn)而影響細(xì)胞之間的物質(zhì)交換和信號傳遞而導(dǎo)致細(xì)胞功能異常。研究表明，GJIC功能異常與肝臟癌變的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系［5］。

4 HCC中GJIC的異常及可能機(jī)制

HCC組織中存在兩種類型GJ，一種是同型GJ（正常細(xì)胞間及腫瘤細(xì)胞間的GJ）；另一種是異型GJ（腫瘤細(xì)胞與周圍正常細(xì)胞間的GJ）。惡性程度不同的HCC組織均存在腫瘤細(xì)胞間同源性、腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞間異源性通訊功能的缺陷，使腫瘤細(xì)胞逃避了鄰近正常細(xì)胞的調(diào)控，經(jīng)過選擇性生長最終形成惡性腫瘤，可能是HCC發(fā)生的重要機(jī)制。GJIC異常主要表現(xiàn)為Cx的異常，其分子機(jī)制可能與以下幾方面有關(guān)：⑴有功能的Cx表達(dá)降低。研究表明，在多數(shù)腫瘤（包括HCC）的形成過程中，常伴隨Cx的表達(dá)降低或缺失。恢復(fù)腫瘤細(xì)胞Cx的表達(dá)水平，可抑制腫瘤細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)其分化，有利于重建正常細(xì)胞的生長調(diào)控機(jī)制。Cx被公認(rèn)為一種抑癌基因［3，12］。如在HCC發(fā)生過程中，Cx32基因敲除的小鼠因為缺乏功能性的GJIC，導(dǎo)致自發(fā)性或化學(xué)誘導(dǎo)的HCC發(fā)生率明顯增加［13］；Plante等［14］在六氯苯（hexachlorobena，HCB）致雌鼠癌變動物模型中發(fā)現(xiàn)，Cx32和Cx26的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下降，同時其介導(dǎo)的GJIC功能也減弱，進(jìn)一步研究證實(shí)HCB誘導(dǎo)的GJIC下降發(fā)生于雌鼠肝癌形成前。提示Cx和GJIC下調(diào)形成于化學(xué)誘導(dǎo)的肝癌形成的早期階段。由此Plante等［14］提出將Cx32的表達(dá)下降作為肝臟腫瘤的一個早期標(biāo)志。應(yīng)用免疫組化進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，人HCC組織樣本中Cx32mRNA及蛋白的表達(dá)水平較癌旁正常肝組織顯著減少［15］。而在體外向肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cx32上調(diào)GJIC則能抑制癌細(xì)胞增殖速度和克隆形成［6］。⑵Cx基因突變。研究證實(shí)特異Cx的突變與各種遺傳性疾病的發(fā)生有關(guān)［16］，而Cx基因突變與腫瘤是否有關(guān)成為近年研究者們研究的熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，在12只化學(xué)誘導(dǎo)致HCC的大鼠中只有1只發(fā)生Cx32基因220位密碼子的突變［17］，而且這種組氨酸向精氨酸的突變在功能上是沉默的，因為熒光染料示蹤實(shí)驗顯示Cx32仍對不同的刺激如cAMP和溶血磷脂酸有正常反應(yīng)［3］。在人類散在性結(jié)腸癌中也發(fā)現(xiàn)Cx43基因的特異性突變，可能與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)［18］。但目前尚未有關(guān)Cx43基因在HCC中突變的報道。Cx基因被認(rèn)為是一種區(qū)別p53基因的非突變型腫瘤抑制基因，亦被稱為第二類非突變抑癌基因。（3）異常Cx的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在正常肝細(xì)胞中檢測不到的Cx43可出現(xiàn)在腫瘤浸潤組織中［19］，提示肝臟組織中Cx的異常錨定并不取決于其表達(dá)的Cx類型，而其異常表達(dá)與腫瘤形成的階段有關(guān)。Zhang等［20］發(fā)現(xiàn)Cx43在HuH7細(xì)胞中的表達(dá)量是在另一種惡性程度相對較低的HepG2細(xì)胞的100倍，Cx43異常上調(diào)的同時，Cx32 mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，猜測可能是由于Cx43通過與Cx32的轉(zhuǎn)錄因子如HNF-1（hepatic nuclear factor-1）相互作用而降低了Cx32啟動子的活性，進(jìn)而使Cx32介導(dǎo)的GJIC功能降低，最終導(dǎo)致HuH7細(xì)胞失去周圍正常細(xì)胞的調(diào)控而致使惡化不斷進(jìn)展。因此有學(xué)者把HCC中Cx43的異常出現(xiàn)視為“去分化過程（dedifferentiation process）”的一個標(biāo)志。雖然目前對于異常Cx43表達(dá)的機(jī)制仍未清楚，但該現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為探索HCC進(jìn)展的分子機(jī)制提供新思路。（4）Cx蛋白分布異常。Nakashima等［15］應(yīng)用免疫組化進(jìn)行定位及定量研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中不僅存在Cx32數(shù)量的下降，且所有Cx32表達(dá)陽性的細(xì)胞均出現(xiàn)分布異常（除少數(shù)樣本同時可見部分細(xì)胞膜表達(dá)，大多數(shù)Cx32僅異位表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中），并且把這一現(xiàn)象歸因于Cx的內(nèi)化作用（internalization）。體外實(shí)驗發(fā)現(xiàn)HuH7肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)的Cx32同樣定位于細(xì)胞質(zhì)而不形成功能性的GJIC［21，22］，當(dāng)把HuH7細(xì)胞接種到SCID小鼠體內(nèi)時，細(xì)胞質(zhì)高表達(dá)的Cx32可以促進(jìn)HuH7細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力［22］。這一發(fā)現(xiàn)改變了Cx異常定位僅被視為GJIC下調(diào)原因之一的觀點(diǎn)?，F(xiàn)今認(rèn)為，雖然Cx32介導(dǎo)的正常GJIC功能能夠抑制HCC的發(fā)生，但一旦肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Cx32蛋白的過多蓄積可能增強(qiáng)癌細(xì)胞的運(yùn)動和侵襲能力而與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。

目前Cx在細(xì)胞質(zhì)異常定位的分子機(jī)制尚不清楚，有學(xué)者認(rèn)為與另一類的連接蛋白如鈣黏蛋白（E-cadherin）的作用有關(guān)，因為腫瘤細(xì)胞中常伴隨Cx與E-cadherin的共下調(diào)或異常定位［23，24］。E-cadherin作為參與上皮細(xì)胞間識別過程中的主要蛋白，它的異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞間的識別損傷，使Cx蛋白未能準(zhǔn)確定位到細(xì)胞膜上。

5 GJIC在HCC防治中的作用

研究證實(shí)，Cx基因的表達(dá)對絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的生長起負(fù)調(diào)控作用，GJIC功能的恢復(fù)表現(xiàn)為腫瘤生長控制和轉(zhuǎn)化表型抑制，因此上調(diào)或恢復(fù)腫瘤細(xì)胞間的GJIC水平可能為腫瘤治療提供新思路和策略。究其原因，Cx基因不僅本身可抑制腫瘤，還可促進(jìn)其他腫瘤治療方法的療效。如藥物等損傷因素在引起細(xì)胞死亡的同時，可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生某種“死亡信號”，這種“死亡信號”通過GJIC傳遞到毗鄰的細(xì)胞，引起相鄰細(xì)胞的死亡從而擴(kuò)大了藥物的細(xì)胞毒性，即所謂的“旁觀者效應(yīng)（bystander effect，BE）”。BE不僅可在腫瘤化療［25，26］過程中觀察到，也是腫瘤放療［27］和基因治療［28］一個顯著的特性。根據(jù)BE的發(fā)生機(jī)制，增強(qiáng)GJIC功能的療法或藥物有望用于腫瘤治療和逆轉(zhuǎn)耐藥，這已被多個研究（包括本課題組）證實(shí)［29，30］。此外，提高腫瘤細(xì)胞GJIC功能，還可使靠近血管的細(xì)胞在獲取藥物、氧和營養(yǎng)后，由GJ運(yùn)至遠(yuǎn)處細(xì)胞，從而使藥物在腫瘤組織內(nèi)均勻彌散，增強(qiáng)化療藥物的治療效果。

如果在早期癌變階段，恢復(fù)腫瘤間和腫瘤與周圍正常細(xì)胞間的異常GJIC功能，可能可以干預(yù)甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤的進(jìn)程。因為化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞癌變需要多個相關(guān)基因的突變，其中一個可能發(fā)生在化學(xué)致癌劑對細(xì)胞的啟動時，而多數(shù)是在其后長達(dá)數(shù)月的時間內(nèi)完成。在這段時間里，組織內(nèi)源性的因子誘發(fā)了進(jìn)一步的基因突變。而處于封閉狀態(tài)的局部組織容易產(chǎn)生這些致突變因子［31］。因此我們推測，當(dāng)肝細(xì)胞接受內(nèi)源性或外源性致癌因素后，小鼠肝GJIC功能的下降，使已經(jīng)處于啟動的惡性細(xì)胞失去周圍正常細(xì)胞對其調(diào)控，恰好形成這種相對封閉的狀態(tài)。因而，及時上調(diào)GJIC水平，解除這種狀態(tài)可能有助于阻止進(jìn)一步的基因突變。另一方面，GJIC能力正?；虮粡?qiáng)化時，正常細(xì)胞可向被啟動的細(xì)胞輸入信號物質(zhì)，使之也正?；?，而不致發(fā)展成癌細(xì)胞［3］。人類肝癌一般潛伏期更長，因此及時上調(diào)或恢復(fù)GJIC功能可能更有利于阻斷肝細(xì)胞進(jìn)一步惡變。目前可通過化學(xué)藥物（如維甲酸［30，32］、類固醇類［11］、cAMP［32］等）誘導(dǎo)Cx蛋白的表達(dá)，或通過基因治療［33］等手段提高GJIC水平。

綜上所述，GJIC的功能異常與HCC的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。Cx基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制異常引起的GJIC缺陷，導(dǎo)致細(xì)胞間通訊功能障礙、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。未來通過研究不同來源HCC組織和細(xì)胞中GJIC表達(dá)模式和規(guī)律，對進(jìn)一步深入了解HCC發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，為其治療提供新的靶點(diǎn)和治療策略具有重要意義。同時應(yīng)積極尋找改善腫瘤細(xì)胞GJIC的方法和途徑，以進(jìn)一步提高現(xiàn)有腫瘤治療的療效。

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［2014-07-28收稿］［2014-08-29修回］［編輯 羅惠予］

R735.7

A

1674-5671（2014）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.03.20

安徽省自然科學(xué)基金資助項目（1408085QH166）；蚌埠醫(yī)學(xué)院科技發(fā)展基金資助項目（Bykf13A12）

張凱。E-mail：zk29788@163.com