楊 歡，崔曉東，李玉英，王轉(zhuǎn)花*

（山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

Cu2+對苦蕎過敏蛋白TBt的結(jié)構和IgG結(jié)合能力的影響

楊 歡，崔曉東，李玉英，王轉(zhuǎn)花*

（山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

TBt是苦蕎中的主要過敏蛋白，為了研究Cu2+對其結(jié)構及致敏性的影響，本實驗采用熒光光譜法探討Cu2+與TBt的相互作用；圓二色光譜及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳測定其結(jié)構變化；間接性酶聯(lián)免疫和抑制性酶聯(lián)免疫法鑒定C u2+對TBt的IgG結(jié)合能 力的影響。結(jié)果表明：Cu2+和TBt之間存在相互作用，二者以濃度比1∶1形成穩(wěn)定的復合物；圓二色光譜分析表明，TBt的二 級結(jié)構并未發(fā)生明顯的改變；但非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示，Cu2+與TBt作用后，可促使TBt由三聚體進一步聚合形成六聚體。 同時抑制性酶聯(lián)免疫和間接性 酶聯(lián)免疫也表明，Cu2+與TBt作用形成六聚體后，由于抗原決定簇被部分遮擋，與IgG抗體結(jié)合能力降低。

苦蕎麥；過敏蛋白；金屬離子；致敏性

蕎麥是我國重要的傳統(tǒng)雜糧作物，具有較高的營養(yǎng)、藥用及保健價值[1]。蕎麥中富含礦物質(zhì)、膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素等生物活性物質(zhì)，尤其是富含其他糧食作物沒有的黃酮類化合物（蘆丁和槲皮素），這些物質(zhì) 能有效地預防糖尿病、高血壓和冠心病等多種慢性疾病[2]，近年來，受到科學家和消費者的普遍關注，有諸多蕎麥功能食品問世，并被大眾認可。然而，蕎麥中也存在著一些致敏成分，部分人食用或接觸蕎麥產(chǎn)品會引起過敏癥狀，如哮喘、皮炎等，甚至可致人死亡[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)蕎麥中的致敏源主要包括9～12、16～19、22～24、35、 58 kD分子質(zhì)量不等的幾種蛋白質(zhì)，其中24 kD過敏蛋白被認為是主要過敏原[5]。先前，本課題組以苦蕎麥為材料，先后通過分離純化和基因克隆等方法獲得天然和重組24 kD（TBa）和34 kD（TBb）過敏蛋白，并對其結(jié)構及致敏性進行了較系統(tǒng)的研究[5-6]，發(fā)現(xiàn)TBa和TBb可通過一對鏈間二硫鍵形成分子質(zhì)量為56 kD（TBt）的過敏蛋白。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TBt在天然狀態(tài)下以三聚體的形成存在[7]，經(jīng)序列比對等結(jié)果表明TBt與普通蕎麥中13S球蛋白[8-9]、苦杏仁中的11S球蛋白等具有較高的同源性[10]，但后兩者在天然狀態(tài)下是以六聚體的形式存在，并且苦杏仁中11S球蛋白每個單體可結(jié)合一個Ca2+。有文獻報道，蕎麥中含有多種微量元素，其中，Cu是蕎麥資源的特征微量元素[11]，這些微量元素對功能蛋白質(zhì)和酶的表達及活性可能起著重要的調(diào)控作用。為了深入研究雜糧作物蕎麥中的過敏成分與金屬離子或小分子活性物質(zhì)間的相互關系，本實驗通過分離、純化獲得天然苦蕎主要過敏原TBt，采用熒光光譜法研究了TBt與Cu2+的相互作用，并且采用圓二色光譜和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（native-polyacrylamide gel electropheresis，native-PAGE）觀察其二級結(jié)構和空間結(jié)構變化，酶聯(lián)免疫檢測Cu2+引起的TBt結(jié)構變化及其IgG結(jié)合能力的影響。本研究旨在闡明Cu2+對TBt的結(jié)構及功能的影響，這也有助于了解金屬離子對植物貯藏蛋白的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

苦蕎麥品種為湖南一號，系當年收獲的種子。

辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 美國Southern Biotech公司；底物-鄰苯二胺溶液 美國Sigma公司；特異性過敏原TBt多克隆抗體 本實驗室自制[12]；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Resource Q、Superdex G-75層析柱、AKTA Explorer蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國GE公司；Bio-kine. PMS 450圓二色光譜儀 法國Bio-Logic公司；ELx800酶標儀 美國寶特公司。

1.2 方法

1.2.1 苦蕎過敏蛋白的分離和純化

參照本實驗室之前建立的制備天然過敏蛋白的方法[7]，脫脂蕎麥粉經(jīng)過緩沖液抽提、鹽析、離子交換層析、凝膠層析等分離純化步驟，獲得電泳純的過敏蛋白TBt。

1.2.2 熒光光譜分析

在熒光比色皿中準確加入1 mL 1×10-6mol/L TBt溶液，并逐次加入1～100 μL 1×10-4mol/L的Cu2+溶液進行熒光滴定，每次加入溶液后混合均勻，在設定的溫度（298、310 K）條件下作用3 min，以波長280 nm為激發(fā)波長，激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫寬度均為5 nm，在熒光分光光度計上記錄300～400 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。將330 nm波長處的熒光強度差值（F－F0）對Cu2+與TBt濃度比（c（Cu2+）∶c（TBt））作圖，判斷Cu2+與TBt的結(jié)合位點數(shù)。F0為只有TBt存在時反應體系在330 nm波長處的熒光強度；F為滴加Cu2+后的反應體系在330 nm波長處的熒光強度。

1.2.3 圓二色光譜分析

室溫下以緩沖液為參比，在Bio-kine. PMS 450儀中測定TBt和Cu2+作用后的圓二色光譜（加樣方法同上）。實驗中共掃描3次，取平均值，采用K2D2 server和CD Pro軟件計算二級結(jié)構的百分含量。

1.2.4 Native-PAGE分析

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳采用4%濃縮膠，10%分離膠，恒流20 mA，電泳完畢經(jīng)染色、脫色后分析。

1.2.5 抑制性酶聯(lián)免疫和間接性酶聯(lián)免疫

抑制性酶聯(lián)免疫按照以下步驟進行：將TBt用抗原包被液稀釋為100 μg/mL，每孔加入100 μL，包被96孔酶標板，4 ℃過夜，棄去孔內(nèi)液體，洗滌液洗3次，每次5 min。加入100 μL/孔1%脫脂奶粉，37 ℃封閉1 h，洗滌液洗3次，每次10 min。測試樣品包括陽性對照組（包被緩沖液100 μL），陰性對照組（TBt 100 μL，質(zhì)量濃度為100 μg/mL），樣品組3組(Cu2+-TBt混合溶液100 μL，c（Cu2+）∶c（TBt）濃度比分別為1∶1、5∶1、10∶1），各組樣品經(jīng)37 ℃孵育30 min后加入稀釋的TBt多克隆抗體（1∶30 000）100 μL/孔，同時設空白對照組（不加多克隆抗體）。各組樣品經(jīng)37 ℃孵育30 min后，加入96孔酶標板，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗滌3次，每次10 min。加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，洗滌液洗3次，每次10 min，加入100 μL 0.8 mg/mL底物鄰苯二胺溶液，暗處顯色15 min，每孔加入50 μL 1 mol/L的稀硫酸，終止反應，酶標儀上測波長490 nm處的光密度值，每組數(shù)據(jù)設定3個復孔，每次重復3次，計算平均值。

間接性酶聯(lián)免疫按照文獻[13]進行，每組數(shù)據(jù)設定3個復孔，每次重復3次，計算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 TBt的純化

按照方法1.2.1節(jié)經(jīng)兩步純化，獲得純度達到95%以上的苦蕎過敏原TBt（圖1），可用于后續(xù)的實驗。

圖1 非還原SDS-PAGE分析TBt蛋白Fig.1 Non-reducing SDS-PAGE analysis of purified TBt

2.2 熒光光譜分析

圖2 TBt與Cu2+的熒光發(fā)射光譜Fig.2 Fluorescence emission spectra of TBt-Cu2+complexes

圖3 Cu 3 Cu2+2+與TBt結(jié)合位點數(shù)的確定Fig.3 Binding sites of TBt with Cu2+

如圖2所示，隨著Cu2+的不斷滴加，在330 nm處TBt內(nèi)源熒光發(fā)生淬滅。如圖3所示，隨著Cu2+濃度的滴加，熒光強度在c（Cu2+）∶c（TBt）＜1∶1之前基本呈線性降低趨勢，表明在這部分的滴定中加入的Cu2+完全與過敏蛋白TBt作用；c（Cu2+）∶c（TBt）＞1∶1后，熒光強度隨著c（Cu2+）∶c（TBt）的增加而減少的程度逐漸減低。當c（Cu2+）∶c（TBt）＞5∶1以后，Cu2+與TBt的結(jié)合達到飽和狀態(tài)，起始的直線與飽和時的直線交于c（Cu2+）∶c（TBt）為1.15∶1，表明Cu2+與TBt之間的結(jié)合位點約為1∶1。

2.3 圓二色光譜分析

圖4 Cu 4 Cu2+2+-TBt作用后的圓二色光譜Fig.4 Circular dichroism spectra of TBt-Cu2+complexes

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構和分子中的肽鍵是高度并且有規(guī)律排列的。本實驗中，當TBt與Cu2+作用后圓二色光譜峰發(fā)生了微小變化，通過K2D2 server和CD Pro軟件分別計算TBt及Cu2+與TBt作用后二級結(jié)構含量表明（圖4），TBt的α-螺旋含量為15.1%，β-折疊的含量為35.27%。Cu2+與TBt作用后α-螺旋含量在14.62%到15.1%之間（P值均大于0.05），β-折疊含量在35.27%到36.57%之間（P值均大于0.05），說明Cu2+的存在，TBt的二級結(jié)構并未發(fā)生明顯變化，主要以β-折疊結(jié)構為主，這與Cupin家族蛋白的結(jié)構特征相一致[13]。

2.4 Native-PAGE分析

圖5 Native-PAGE分析TBt與Cu2+的相互作用Fig.5 Interaction analysis of TBt with Cu2+by native PAGE

已知牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）在Native-PAGE中通常會出現(xiàn)多種聚合體，本實驗以BSA為參照，通過電泳表征在TBt中加入Cu2+后對其聚合狀態(tài)的影響。從圖5可見，TBt（泳道2）呈現(xiàn)明顯的單一條帶，與BSA比對，TBt大部分以三聚體的天然構象存在（與BSA三聚體位置接近），而加入Cu2+后（泳道3），在TBt三聚體上方有明顯的條帶出現(xiàn)，TBt發(fā)生了聚合。由此推斷TBt與Cu2+相互作用后，使典型Cupin家族的過敏原TBt由三聚體進一步聚合形成部分六聚體。雖然在圓二色光譜實驗中未見二級結(jié)構改變，但此處顯示Cu2+可使TBt的高級結(jié)構發(fā)生明顯變化。

2.5 抑制性酶聯(lián)免疫和間接酶聯(lián)免疫檢測

由圖6A可見，抑制性酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果，Cu2+的加入會不同程度的減弱苦蕎過敏蛋白TBt的致敏性。結(jié)合Native-PAGE的結(jié)果進一步推出，Cu2+的存在可能改變了苦蕎過敏蛋白TBt的天然構象，促使TBt結(jié)構由三聚體轉(zhuǎn)變?yōu)榱垠w，TBt由兩個三聚體靠弱作用力相互結(jié)合形成六聚體，結(jié)合部位的抗原決定簇被部分遮擋，從而使其IgG結(jié)合能力降低。但間接酶聯(lián)免疫（圖6B）顯示，用TBt以及TBt與不同濃度Cu2+復合物包被酶標板后，檢測結(jié)果未見明顯的變化?？赡茉蚴荰Bt形成的六聚體的穩(wěn)定性較差，在非離子去污劑等的作用下會發(fā)生解離。

圖6 TBt的ELISA檢測結(jié)果Fig.6 Detection of TBt by ELISA

圖7 TBt與Cu2+作用后的空間結(jié)構變化Fig.7 Changes in spatial structure after Cu2+-TBt interactions

根據(jù)已報道的苦杏仁和大豆中11S球蛋白的結(jié)構特點[10,14]，結(jié)合上述實驗結(jié)果，本實驗提出TBt以及TBt-Cu2+相互作用的模型（圖7）。圖中表明TBt主要以三聚體的形式存在，而當加入Cu2+后，兩個三聚體以“面對面”的形式聚合形成六聚體，從而使其比表面積降低，在與抗體結(jié)合時，結(jié)合的IgG量減少。

3 討 論

研究表明，蕎麥中的礦物元素含量明顯高于其他糧食作物，含有微量元素Fe、Ca、P、Cu、Zn、Mg和極微量的B、I、Ni、Co、Se等[15]。茍君波等[11]應用主成分和聚類分析法對蕎麥資源中金屬元素進行分析，結(jié)果表明，Cu、Mg、Mo、Cd是蕎麥資源的特征元素。金屬離子對植物種子中貯藏蛋白的結(jié)構及活性有較大的影響，如大豆的ASR蛋白（abscisic acid-, stress-, and ripeninginduced protein）在Fe3+和Zn2+的作用下可以發(fā)生聚合[16]。許多已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物過敏原也都可以和金屬離子發(fā)生作用，進而影響其致敏活性，如榛子過敏原Cor h 1[17]、狗牙草過敏原Cyn d 7[18]、橄欖樹過敏原Ole e 3[19]、樺樹花粉過敏原Bet v 3和Bet v 4[20-21]等都可以和Ca2+結(jié)合，并且這些過敏原的IgG結(jié)合能力在一定程度上會受Ca2+的調(diào)控。本實驗在研究Cu2+與TBt作用的同時，分別研究了Fe2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+與TBt的相互作用，結(jié)果表明，除了Cu2+外，其余5種金屬離子對TBt的作用均不明顯（結(jié)果略）。

目前，蕎麥功能產(chǎn)品受到了國內(nèi)外消費者的廣泛關注，但食用和接觸后的過敏癥狀也時有報道。先前的研究已對其過敏的可能機制進行了探討，通過基因突變，提出過敏原表位關鍵氨基酸的重要作用[5]，但有關金屬離子與蕎麥過敏原的結(jié)構及致敏性之間的關系還未見報道。上述實驗通過光譜法（熒光光譜，圓二色光譜）和酶聯(lián)免疫法對Cu2+與TBt作用后的一系列變化進行了研究，實驗表明TBt易受到Cu2+的影響，Cu2+與TBt有較強的結(jié)合作用，通過靜態(tài)猝滅的方式導致TBt內(nèi)源熒光減弱；對兩者結(jié)合后的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和熱力學參數(shù)計算，推測靜電作用力為兩者的主要結(jié)合力；圓二色光譜探討了Cu2+對TBt二級結(jié)構的影響，得出Cu2+與TBt相互作用后其二級結(jié)構未發(fā)生明顯變化。Native-PAGE分析和酶聯(lián)免疫檢測均顯示，Cu2+與TBt作用后，可使典型Cupin家族的過敏原TBt由三聚體進一步聚合形成部分六聚體，IgG結(jié)合能力有所降低。食物或環(huán)境因素等引起的過敏是一個非常復雜的生化和免疫學問題。有關金屬離子對過敏蛋白IgG結(jié)合能力的影響及其與過敏蛋白結(jié)合后的空間結(jié)構變化等有待進一步研究。

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Effects of Cu2+on Molecular Structure and IgG Binding Capacity of the Tartary Buckwheat Allergic Protein TBt

YANG Huan, CUI Xiao-d ong, LI Yu-ying, WANG Zhuan-hua*
(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

This study aimed to examined the effect of Cu2+on the structure and allergenicity of TBt, a major allergen in tartary buckwheat. Experiments were carried out to explore the interaction between TBt and Cu2+by fluorescence spectroscopy, analyze the structural change of TBt by circular dichroism (CD) spectroscopy and native polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), and identify the effect of Cu2+on its IgG binding capacity by indirect ELISA and inhibitory ELISA. The results of the fluorescence spectroscopic analysis indicated that Cu2+could be bound to TBt at a molar ratio of 1:1. CD analysis showed the secondary structure of TBt did not change, but the spatial structure of TBt was changed in native PAGE. Briefly, the spatial structures of TBt changed into hexamers after interaction with Cu2+. Inhibitory ELISA and indirect ELISA showed that TBt became a hexamer, and a part of epitopes were covered and the IgG binding capacity was decreased.

tartary buckwheat; allergenic protein; metallic ions; allergenicity

Q516；R392

A

1002-6630（2014）05-0028-05

10.7506/spkx1002-6630-201405006

2013-09-23

國家自然科學基金面上項目（31171659）；太原市科技攻關項目（100622）

楊歡（1988—），男，碩士研究生，研究方向為蛋白質(zhì)化學與工程。E-mail：201123002014@sxu.edu.cn

*通信作者：王轉(zhuǎn)花（1956—），女，教授，博士，研究方向為蛋白質(zhì)工程與生物活性物質(zhì)。E-mail：zhwang@sxu.edu.cn