齊永帥 黃寶丹 杜 麗 張 輝 黃 凱 李貴平

腦膠質(zhì)瘤U87-EGFRvIII細胞反義寡核苷酸的188Re標(biāo)記實驗研究

齊永帥 黃寶丹 杜 麗 張 輝 黃 凱 李貴平

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科 廣州 510515）

研究放射性核素錸(188Re)標(biāo)記腦膠質(zhì)瘤U87-EGFRvIII(Epidermal Growth Factor Receptor Variant III)細胞反義寡核苷酸序列的制備方法，探討其作為腦膠質(zhì)瘤反義顯像劑的可能性。采用細胞指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)(Cell-based Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, Cell-SELEX)篩選腦膠質(zhì)瘤U87-EGFRvIII細胞，得到一段高親和力的反義寡核苷酸序列U2，然后采用直接標(biāo)記法進行188Re的放射性標(biāo)記，按照正交實驗設(shè)計進行188Re最佳標(biāo)記條件的摸索，紙層析法測定標(biāo)記率，通過體外穩(wěn)定性實驗評價188Re-U2的放化特性，測定標(biāo)記物靜脈注射后在大耳兔不同時相血液放射性清除曲線，應(yīng)用SPECT顯像觀察標(biāo)記物在兔體內(nèi)的放射性動態(tài)分布變化。結(jié)果表明：在最佳標(biāo)記條件下188Re-U2的標(biāo)記率為70%±14%；經(jīng)Sep-PaK C18反相柱分離純化后，188Re-U2在生理鹽水和血清中37 °C下放置24 h的放化純度分別為70.6%和95.55%；188Re-U2在兔體內(nèi)的血放射性清除迅速，主要通過腎臟排泄，其余臟器內(nèi)放射性均較低。188Re直接法標(biāo)記U87-EGFRvIII細胞反義寡核苷酸U2的方法簡單，具有良好的標(biāo)記率和體內(nèi)外穩(wěn)定性，并且體內(nèi)分布動力學(xué)特性也比較理想。

腦膠質(zhì)瘤，反義寡脫氧核苷酸，188Re，放射性標(biāo)記

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤，國內(nèi)病例資料統(tǒng)計占35.26%-60.96%，平均為44.69%。表皮生長因子受體III型突變體(Epidermal Growth Factor Receptor Variant III, EGFRvIII)是膠質(zhì)母細胞瘤中最常見的突變體，在正常組織細胞中不表達，僅在腫瘤細胞中表達，而且與腫瘤的侵襲性和致瘤性密切相關(guān)[1-3]。通過Cell-SELEX 技術(shù)篩選U87-EGFRvIII細胞得到高純度寡核苷酸序列U2[4]。本研究應(yīng)用放射性核素標(biāo)記技術(shù)對獲得的腦膠質(zhì)瘤細胞反義寡核苷酸U2進行標(biāo)記，探討采用直接標(biāo)記法進行188Re標(biāo)記的可行性，評價188Re-U2的放化特性，觀察188Re-U2在正常動物體內(nèi)動力學(xué)特性及顯像特點，為其進一步研究與應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1 寡核苷酸序列

本研究所得到的高純度寡核苷酸序列5’-ATCCA-GAGTGACGCAGCATTTTG ACGCTTTA TCCTTTTCTTATGGCGGGATAGTTTCGTGGACA CGGTGGCTTAGT-3’由南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室張興梅教授提供，該序列被命名為U2。

1.1.2 實驗動物

新西蘭雄性大耳兔3只，體重2-2.5 kg，普通級，南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物飼養(yǎng)及實驗操作經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.3 化學(xué)試劑及放射性188Re

氯化亞錫(SnCl2)購于廣東光華科技股份有限公司；抗壞血酸(VitC)購于成都市科龍化工試劑廠；其它化學(xué)試劑均購自Sigma公司。188W-188Re發(fā)生器購于德國ITG公司。

1.1.4 主要儀器

FA604A電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；600型恒溫水箱（江蘇金壇市中大儀器廠）；ZD-3回旋振蕩器（天津市歐諾儀器表有限公司）；SN-682型放射免疫γ計數(shù)器（上海核福光電儀器有限公司）；KDC-2044低速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；Millennium VG 型SPECT顯像儀由美國GE公司生產(chǎn)。

首先，知識產(chǎn)權(quán)評議為產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整提供技術(shù)指引，并為政策績效評估提供關(guān)鍵指標(biāo)。一個國家或地區(qū)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的布局與調(diào)整，是政治、經(jīng)濟和社會等多方面因素綜合考量的結(jié)果，而技術(shù)因素和知識產(chǎn)權(quán)因素亦在其中占據(jù)著重要地位。在重點扶持產(chǎn)業(yè)確定以前，通過事前的知識產(chǎn)權(quán)評議，可以評估本國或本地區(qū)在該產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新能力與比較優(yōu)勢，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)實和潛在的知識產(chǎn)權(quán)風(fēng)險，預(yù)測產(chǎn)業(yè)發(fā)展的知識產(chǎn)權(quán)前景；而在重點扶持產(chǎn)業(yè)和扶持政策確定以后，就需要通過知識產(chǎn)權(quán)評議對該產(chǎn)業(yè)的技術(shù)創(chuàng)新和知識產(chǎn)權(quán)發(fā)展態(tài)勢進行監(jiān)測與分析，對產(chǎn)業(yè)政策的績效進行動態(tài)評估，并且適時進行政策修訂、決定政策退出或出臺新的政策。

1.2實驗方法

1.2.1 寡核苷酸的188Re標(biāo)記

采用直接標(biāo)記法進行U2的188Re標(biāo)記，分別對U2反應(yīng)量(40 μg、20 μg、10 μg)、氯化亞錫用量(3 mg、1.5 mg、0.75 mg)、標(biāo)記體系pH(2、3、4)逐一進行試驗，采用正交設(shè)計進行分析，以尋找最佳標(biāo)記條件。188Re直接標(biāo)記方法如下：取高純度U2溶于約pH=7.5的10 μL磷酸緩沖液(Phosphate Buffer Saline, PBS)溶液置于1.5 mL EP管中，震蕩混勻，加入新配制的50 μL氯化亞錫(SnCl2)溶液，再加入300 μL188Re(18.5-25 MBq)淋洗液，最后再加入10 mg·mL-1抗壞血酸100 μL溶液，震蕩混合后置于37 °C水浴1.5 h。

1.2.2188Re的標(biāo)記率、放化純度和穩(wěn)定性測定

標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后取少量樣品，采用紙層析法測定標(biāo)記率以及對層析紙條行SPECT顯像。顯像結(jié)束后分段剪開層析紙條，用γ放射免疫計數(shù)器分別測量每段放射性計數(shù)，依據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物在不同展開劑中的放射性比移值Rf(表1)計算標(biāo)記率。紙層析法的固相為新華I號濾紙，展開劑分別為丙酮（展開劑A）、生理鹽水（展開劑B）和氨水/乙醇/水混合物（展開劑C）；然后標(biāo)記產(chǎn)物進行Sep-PaK C18反相柱分離純化，方法如下：加樣前先以10 mL 無水乙醇、10mL的1 mmol·L-1鹽酸及5 mL空氣清洗Sep-Pak C18反相柱，將100 μL標(biāo)記物188Re-U2上樣后，以10 mL的1 mmol·L-1HCl去除游離的188ReO4-，再以10 mL無水乙醇與生理鹽水(1∶1)洗脫出標(biāo)記的寡核苷酸，收集每管淋洗液1 mL并測出各自放射性計數(shù)，取標(biāo)記峰產(chǎn)物作紙層析分析和SPECT顯像，計算188Re-U2放化純度；再取少量純化的188Re-U2分別在生理鹽水和人血清中于37 °C放置3 h、12 h和24 h，檢測其體外穩(wěn)定性。

表1 反應(yīng)產(chǎn)物在層析紙中的放射性分布Table 1 Radioactivity distribution of reaction products in the chromatography paper.

1.2.3 健康家兔放射性血清除曲線測定

取3只健康雄性新西蘭大耳兔，用18G型號靜脈留置針建立靜脈通道，在建立靜脈通道前30 min肌注1 mL阿托品，再經(jīng)左側(cè)耳緣靜脈分別注射3%戊巴比妥鈉約1.5 mL緩慢推注，然后靜注20MBq/0.5 mL的188Re-U2，于注射后5 min、15 min、30 min、50 min、70 min、90 min、120 min和240 min從右側(cè)后肢股靜脈采血約0.2 mL，準(zhǔn)確稱取質(zhì)量數(shù)，測定血液樣品的放射性計數(shù)，放射性計數(shù)經(jīng)衰減校正后計算每克血液中放射性計數(shù)(cpm·g-1)，繪制時間-放射性曲線。

選1只健康雄性新西蘭大耳兔置于固定器上，探頭視野中線對準(zhǔn)兔胸腹部，使整個兔身完全置于探頭視野范圍內(nèi)，經(jīng)0.22 μm一次性濾器過濾后（未調(diào)整pH值），緣靜脈注射約15 MBq/200 μL188Re-U2后，立刻啟動SPECT顯像儀先以1幀/5 min采集30 in，再以1幀/10 min采集60 min，并于120 min和240 min分別進行延遲顯像，觀察體內(nèi)組織器官放射性的動態(tài)分布變化。

2 結(jié)果

2.1最佳標(biāo)記條件的確定

采用正交試驗設(shè)計法，由此確定最佳標(biāo)記條件為：在室溫37 °C下，取高純度10 μg U2溶于pH=7.5的10 μL磷酸PBS中置于1.5 mL EP管，震蕩混勻后，再加入新配制的50 μL的1.5 mg·mL-1SnCl2溶液，隨即加入300 μL188Re(18.5-25 MBq)淋洗液，最后再加入10 mg·mL-1抗壞血酸100 μL溶液，調(diào)整反應(yīng)體系pH為2左右，震蕩混勻后置于37 °C水浴1.5 h。在此條件下，標(biāo)記率最佳時可達85%。

2.2標(biāo)記率及放化純度測定

最佳標(biāo)記條件下，188Re-U2的標(biāo)記率為70%±14%，經(jīng)Sep-PaK C18反相柱分離純化后188Re-U2的放化純度大于90%，分別對應(yīng)的紙層析條SPECT顯像分析，結(jié)果見圖1。

圖1 紙層析法測定188Re-U2的標(biāo)記率及放化純度左側(cè)為即刻標(biāo)記率的層析結(jié)果，右側(cè)為放化純度紙層析顯像結(jié)果A：丙酮，B：生理鹽水，C：氨水/乙醇/水混合物Fig.1 Paper chromatography for determining of radiolabeling efficiency and radiochemical purity. The left picture show labeling rate immediately after radiolabeling, and the right picture show radiochemical purity after purification. A: acetone, B: physiological saline, C: ammonia water/ethanol/water mixture

2.3188Re-U2的體外穩(wěn)定性測定

當(dāng)氯化亞錫用量分別為3 mg、1.5 mg和0.75 mg時188Re標(biāo)記的U2進行Sep-PaK C18反相柱分離純化，檢測其放射性計數(shù)，即188Re-U2淋洗曲線結(jié)果見圖2。分別取淋洗曲線峰處的188Re-U2置于生理鹽水37 °C條件下放置3 h、12 h和24 h的放化純度測定結(jié)果見圖3(a)，當(dāng)還原劑用量為1.5 mg時，24h放化純度始終大于70%，表明188Re-U2在生理鹽水中的穩(wěn)定性較好；而置于血清37 °C條件下放置3 h、12 h和24 h的放化純度測定結(jié)果見圖3(b)，當(dāng)還原劑用量為1.5 mg時，24 h放化純度始終大于90%，表明188Re-U2在血清中穩(wěn)定性良好。

圖2 188Re-U2的淋洗曲線Fig.2 Elution curves of purified 188Re-U2.

圖3 188Re-U2在生理鹽水(a)和人血清(b)中37 °C溫育24 h的放化純度Fig.3 Radiochemical purity of 188Re-U2 in the physiological saline (a) and human serum (b) at 37 °C for 24 h.

2.4188Re-U2在兔體內(nèi)血放射性清除曲線

靜脈注射后188Re-U2在兔體內(nèi)的血放射性清除曲線測定結(jié)果見圖4。188Re-U2在血液中清除迅速，30 min時放射性約為5 min時的一半。

圖4 188Re-U2在兔體內(nèi)的血清除曲線Fig.4 Blood clearance curve of 188Re-U2 in normal rabbits.

2.5188Re-U2在兔體內(nèi)的SPECT動態(tài)顯像

除靜脈留置套管針注射點有較多放射性滯留外，5 min時正常腦組織(Brain)輕度顯影，心臟(Heart)及肝臟(Liver)顯影清晰，隨時間放射性減低。5 min時雙腎(Kidney)、膀胱(Bladder)可見顯影，20 min時膀胱影濃聚，并隨時間延長放射性增多。2 h肝影明顯減弱，腸道內(nèi)未見放射性濃聚，甲狀腺、胃區(qū)呈放射性減低區(qū)，其余臟器放射性分布較低(圖5)。

圖5 188Re-U2靜脈注射5 min、10 min、20 min、30 min、1 h和2 h后在兔體內(nèi)的SPECT顯像Fig.5 SPECT imaging of 188Re-U2 at 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 1 h and 2 h after injection in normal rabbits.

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)顱內(nèi)腫瘤，發(fā)病率占所有腦腫瘤的70%。其中，多形性膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastoma multiforme, GBM)是最常見的腦腫瘤，其預(yù)后極差，5年存活率不到3%。由于膠質(zhì)瘤惡性度高，呈侵襲生長。傳統(tǒng)手術(shù)不易完全切除腫瘤實體；對放化療治療不敏感、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差[5]。因此建立腦膠質(zhì)瘤早期、特異性的診斷和治療方法已成為臨床腫瘤學(xué)亟需解決的重點問題之一，研制針對膠質(zhì)瘤的新型靶向藥物是膠質(zhì)瘤治療的新方向。表皮生長因子受體III型突變體EGFRvIII是膠質(zhì)瘤中最常見的突變體，在正常組織細胞中不表達，僅表達于腫瘤細胞中，因而是一個很好的腫瘤治療靶點[6-7]。通過Cell-SELEX 技術(shù)，從針對穩(wěn)定過表達表皮生長因子受體III型突變體的U87-EGFRvIII細胞中篩選出與靶受體結(jié)合具有高特異性和高結(jié)合力的寡核苷酸適配子U2。本實驗利用放射性核素標(biāo)記技術(shù)，對寡核苷酸U2進行放射性核素188Re的標(biāo)記。188Re具有理想的核物理和化學(xué)性質(zhì)，物理半衰期為16.9 h，不僅能發(fā)射2.11 MeV的β射線，而且還發(fā)射適合顯像的155 KeV的γ射線，在軟組織中的射程平均為3 mm，對周圍組織損傷小，是最具有發(fā)展?jié)摿Φ闹委熡梅派湫院怂刂?。目前?88Re標(biāo)記各種化合物和生物分子的研究得到廣泛的重視，通過連接外源性螯合基團或采用直接標(biāo)記法，已經(jīng)成功地標(biāo)記單克隆抗體、多肽以及寡核苷酸[8-10]。188Re標(biāo)記方法主要有間接法和直接法，大多數(shù)金屬類放射性核素標(biāo)記寡核苷酸采用間接標(biāo)記法，即先將寡核苷酸與雙功能鰲合劑偶聯(lián)，再采用金屬類核素進行標(biāo)記，缺點是整個制備過程比較復(fù)雜。在參考99Tcm直接法標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上，對188Re標(biāo)記方法進行初步探討，雖然188Re和99Tcm同處一個副族，但其標(biāo)記的條件仍有較大的區(qū)別，本研究在單因素研究基礎(chǔ)上主要對氯化亞錫、反應(yīng)體系的pH、寡核苷酸用量逐一進行實驗分析。

雖然188Re和99Tcm具有相似的化學(xué)性質(zhì)，TcO4-+4H++3e= TcO2+2H2O的還原電位是738 mV，ReO4-+4H++3e=ReO2+2H2O的還原電位是510 mV，其氧化還原電位約220 mV的差異導(dǎo)致錸復(fù)合物在高氧化狀態(tài)的熱力學(xué)穩(wěn)定性高于锝的類似物。因此，188ReO4-的還原是188Re直接標(biāo)記應(yīng)用的關(guān)鍵。+7價錸是188Re最穩(wěn)定的狀態(tài)，不僅是+7價錸還原到低價態(tài)的錸非常困難，而且這種氧化還原反應(yīng)過程是可逆的[11]。本實驗則采用高濃度的SnCl2使+7價錸還原至低價態(tài)的錸，但高濃度的SnCl2易形成沉淀，使白色膠體生成量增加而降低放化純度，所以選用濃HCl進行溶解形成強還原性環(huán)境。99Tcm可以在微量還原劑的條件下完成標(biāo)記，而188Re則需在接近毫克水平的還原劑條件下進行標(biāo)記，實驗結(jié)果顯示當(dāng)氯化亞錫為1.5 mg左右時，標(biāo)記率最高可達80%左右。在加大SnCl2用量的同時，濃鹽酸雖可解決溶液中出現(xiàn)的白色絮狀物，但188Re直接標(biāo)記的緩沖液環(huán)境僅能是在強酸性環(huán)境下進行。許多報道[12-13]認(rèn)為標(biāo)記188Re的理想pH在1-2之間，而標(biāo)記99Tcm的pH在4-7之間，高價錸的還原反應(yīng)一般應(yīng)該在強酸性條件下進行，以降低氯化亞錫和錸形成沉淀。本實驗發(fā)現(xiàn)，在pH較低時標(biāo)記率最高，隨pH值升高，標(biāo)記率逐漸降低，這也可能與低價態(tài)188Re的不穩(wěn)定性有關(guān)。高濃度的氯化亞錫和較低的pH使還原狀態(tài)188Re不易被氧化到高價態(tài)188Re，可能有助于結(jié)合嘌呤環(huán)上鳥苷和嘧啶環(huán)上胞苷。張淑琴[14]認(rèn)為根據(jù)同分異構(gòu)體的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性分析，鳥苷傾向于以N(7)與過渡金屬離子形成2配位，而新的鳥苷則以氫鍵與配位的鳥苷分子結(jié)合形成較為穩(wěn)定的過渡金屬-鳥苷配合物；胞苷則更容易以N(3)和羰基O與過渡金屬離子配位形成4或6非常穩(wěn)定的配合物；一般來說，氮雜大環(huán)化合物對酸催化降解不敏感，在低的pH下具有動力學(xué)穩(wěn)定（由于它們要進入胃和肝臟）。還發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物在未純化之前，標(biāo)記物的即刻標(biāo)記率可達80%左右，可能與溶液中含有較多的Sn2+和H+有關(guān)，保持了溶液的高還原環(huán)境，經(jīng)過Sep Pak C18反相柱分離純化后，SnCl2被分離掉，低價態(tài)的188Re很容易氧化至高價態(tài)188Re，價位的改變使得188Re從標(biāo)記物上脫落，放射化學(xué)純度僅為50%左右。37 °C條件下該標(biāo)記物在生理鹽水和血清中的穩(wěn)定性良好，不過在生理鹽水中標(biāo)記物的放化純度低于在血清中，可能與輻射自分解和pH環(huán)境有關(guān)：(1) 一般認(rèn)為標(biāo)記物的放射性濃度越高，分解越嚴(yán)重；(2) 血漿蛋白可以起到保護標(biāo)記物，減輕輻射分解的作用；(3) 生理鹽水可能緩沖了標(biāo)記物溶液的酸性環(huán)境，而長時間放置的血清是偏酸的對標(biāo)記物的酸性環(huán)境影響不明顯。從本實驗結(jié)果看，標(biāo)記緩沖液的pH環(huán)境對標(biāo)記率影響較大。為此，有研究報道采取注射前分離純化和調(diào)整pH的方法，這樣可以避免188Re被氧化，保持標(biāo)記物的體外穩(wěn)定性。

有關(guān)標(biāo)記物中加入抗壞血酸或者龍膽酸作為穩(wěn)定劑或者保護劑，可以防止標(biāo)記物被氧化和氯化亞錫水解形成沉淀，還可以充當(dāng)自由基清除劑以減少射線對標(biāo)記物的輻射損傷作用，有利于提高標(biāo)記物的穩(wěn)定性[15]。因此本實驗在標(biāo)記物中適當(dāng)加入抗壞血酸穩(wěn)定劑，經(jīng)Sep Pak C18反相柱純化后，放化純度在生理鹽水中仍保持大于70%，在血清中大于94%，說明抗壞血酸可以提高標(biāo)記物體外穩(wěn)定性，具有一定的保護作用。

188Re-U2的SPECT動物顯像顯示標(biāo)記物在正常腦組織輕度顯影，腎臟、膀胱等部位高度濃聚，除軟組織、胃腸道等部位濃聚較少，肝臟有一過性濃聚，由于肝臟具有強大的生物轉(zhuǎn)化、分泌、合成、代謝功能，可經(jīng)過肝臟代謝導(dǎo)致標(biāo)記物在體內(nèi)被迅速清除。188Re-U2主要通過腎臟排泄，對放射性藥物來說是一種較好的代謝途徑。本文研究結(jié)果表明應(yīng)用放射性核素錸直接法標(biāo)記寡核苷酸U2的方法簡單，且在體內(nèi)外具有良好的穩(wěn)定性以及理想的體內(nèi)分布動力學(xué)特性，但考慮到188Re標(biāo)記U2的標(biāo)記率有待提高，仍需進一步優(yōu)化標(biāo)記條件，為下一步開展腦膠質(zhì)瘤荷瘤裸鼠動物模型的反義顯像和反義治療的研究提供實驗基礎(chǔ)。

致謝感謝南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室張興梅教授提供U2。

1 Chandramohan V, Bigner D D. A novel recombinant immunotoxin-based therapy targeting wild-type and mutant EGFR improves survival in murine models of glioblastoma[J]. Oncoimmunology, 2013, 2(12): e26852-1-e26852-2

2 Muthusamy K A, Lian L H, Vairavan N, et al. Genetic polymorphisms of EGF 5'-UTR and NAT2 857G/A associated with glioma in a case control study of Malaysian patients[J]. Genetics and Molecular Research, 2012, 11(3): 2939-2945

3 鄭帥, 許豪, 劉華杰, 等. HMGA1在腦膠質(zhì)瘤侵襲性及其血管生成中的作用[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2014, 52(2): 1-5

ZHENG Shuai, XU Hao, LIU Huajie, et al. Expression of HMGA1 in the invasion and angiogenesis of human gliomas[J]. Journal of Shandong University (Health Sciences), 2014, 52(2): 1-5

4 伍錫棟, 譚燕, 梁惠玉, 等. 針對U87-EGFRvⅢ細胞的適配子對膠質(zhì)瘤荷瘤鼠的抑瘤作用[J]. 華南國防醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 27(6): 372-375

WU Xidong, TAN Yan, LIANG Huiyu, et al. Antitumor effect of aptamer against U87-EGFRvIII cells in tumor-bearing nude mice animal models[J]. Military Medical Journal of South China, 2013, 27(6): 372-375

5 肖鋒, 王洪林. 腦膠質(zhì)瘤放化療研究進展[J]. 中國醫(yī)藥指南, 2012, 10(2): 54-55

XIAO Feng, WANG Honglin. Research progress in chemotherapy for cerebral glioma[J]. Guide of China Medicine, 2012, 10(2): 54-55

6 Safdari Y, Farajnia S, Asgharzadeh M, et al. HumMR1, a highly specific humanized single chain antibody for targeting EGFRvIII[J]. International Immunopharmacol, 2014, 18(2): 304-310

7 Emlet D R, Gupta P, Holgado-Madruga M, et al. Targeting a glioblastoma cancer stem-cell population defined by EGF receptor variant III[J]. Cancer Research, 2014, 74(4): 1238-1249

8 穆傳杰, 韓佩珍. 寡核苷酸適配子在核醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J]. 中華核醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 26(4): 246-249

MU Chuanjie, HAN Peizhen. Application of oligonucleotide aptamers in nuclear medicine[J]. Chinese Journal of Nuclear Medicine, 2006, 26(4): 246-249

9 劉長濱. 放射性锝、銦、釔、錸標(biāo)記Morpholino寡核苷酸及標(biāo)記藥物的生物分布[D]. 第四軍醫(yī)大學(xué), 2003

LIU Changbin. Radiolabeling Morpholino with90Y,111In,188Re,99mTc and its biodistribution in normal mice[D]. The Fourth Military Medical University, 2003

10 Dias C R, Jeger S, Osso J J, et al. Radiolabeling of rituximab with188Re and99mTc using the tricarbonyl technology[J]. Nuclear Medicine and Biology, 2011, 38(1): 19-28

11 Winnard P J, Virzi E, Fogarasi M, et al. Investigations of directly labeling antibodies with rhenium-188[J]. Quarterly Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, 1996, 40(2): 151-160

12 Verdera S, Balter H, Rodriguez G, et al. Labeling and quality control of188Re-lanreotide[J]. Cellular and Molecular Biology (Noisy-le-grand), 2002, 48(7): 741-745

13 Li Q N, Zhang X D, Rong S, et al. Preparation of (188Re) Re-AEDP and its biodistribution studies[J]. Applied Radiation and Isotopes, 2000, 53(6): 993-997

14 張淑琴. 金屬離子與核苷分子相互作用的質(zhì)譜實驗和量子化學(xué)理論研究[D]. 上海大學(xué), 2013

ZHANG Shuqin. Interaction of metal cations with nucleosides: mass spectrometry and quantum chemical calculation study[D]. Shanghai University, 2013

15 Chakrabarti M C, Le N, Paik C H, et al. Prevention of radiolysis of monoclonal antibody during labeling[J]. Journal of Nuclear Medicine, 1996, 37(8): 1384-1388

CLCTL92+3

Experimental study on the labeling of antisense oligonucleotide from U87-EGFRvIII glioma cells with188Re

QI Yongshuai HUANG Baodan DU Li ZHANG Hui HUANG Kai LI Guiping
(Department of Nuclear Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China)

Background:Gliomas, originating from glial cells, are the most common neoplasms affecting the central nervous system, and glioblastoma multiforme is the most malignant subtype of glioma. The classical subtype of glioblastoma is defined by epidermal growth factor receptor (EGFR) gene amplification, and glioblastomas bearing EGFR amplifications often express EGFRvIII. This suggests that EGFRvIII may operate as critical drivers in the genesis of glioblastoma, hence representing ideal targets for targeted anticancer therapies.Purpose:The aim is to establish a radiolabeling method of antisense oligonucleotide (U2) from U87-EGFRvIII glioma cells with radionuclide rhenium (188Re) and to investigate the possibility of using188Re-U2as imaging agents for brain glioma.Methods:A high affinity of antisense oligonucleotide sequences U2from U87-EGFRvIII glioma cells was screened by the cell systematic evolution of ligands by exponential enrichment, and was directly labeled with188Re. The optimal labeling condition and stability in vitro were investigated by an orthogonal experimental design method. Labeling rates were determined by paper chromatography. Blood radioactivity clearance of188Re-U2in rabbits was evaluated by determining blood radioactive concentrations at different time points after injection of188Re-U2, and its dynamic distribution was investigated by SPECT imaging.Results:Antisense oligonucleotide (U2) was successfully radiolabeled with188Re and the labeling rate of188Re-U2was 70%±14%. After purification of the labeled188Re-U2with Sep-PaK C18 reversed phase extraction cartridge, the radiochemical purity was 70.6% after placing in physiological saline for 24 h and 95.55% after incubation at 37 °C with human serum. SPECT imaging showed that188Re-U2could be quickly cleared from the blood in normal animals primarily through the kidneys, and the radioactivity in other tissues and organs remained low.Conclusion:This method of directly labeling antisense oligonucleotide (U2) with188Re is simple with better labeling efficiency and stability both in vitro and in vivo, and so188Re-U2has more ideal biodistribution and biokinetics in vivo.

Brain glioma, Antisense oligonucleotide,188Re, Radiolabeling

TL92+3

10.11889/j.0253-3219.2014.hjs.37.090301

廣東省自然科學(xué)基金項目(No.S2013010014420)、廣東省科技計劃項目(No.2012B031800391)和南方醫(yī)院院長基金項目(No.2012Z008)資助

齊永帥，男，1988年出生，2012年畢業(yè)于濟寧醫(yī)學(xué)院，現(xiàn)為南方醫(yī)科大學(xué)在讀碩士研究生，研究方向為影像醫(yī)學(xué)

李貴平，E-mail: ligp62@126.com

2014-03-07，

2014-04-10