劉靜文，李天明，杜紅燕，馮惠勇*

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050000）

重組酶FLP在弱氧化葡糖桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用

劉靜文，李天明，杜紅燕，馮惠勇*

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050000）

本實(shí)驗(yàn)借助寬宿主載體pBBR1MCS-5，構(gòu)建在弱氧化葡糖桿菌（Gluconobacter suboxydans）中表達(dá)FLP重組酶的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化弱氧化葡糖桿菌，獲得陽性轉(zhuǎn)化子；采用兩步法RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）驗(yàn)證，結(jié)果表明：flp基因在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)；將pBBR1MCS-psldh-flp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至帶有四環(huán)抗性的突變菌株JGDH－，PCR驗(yàn)證表明帶有FTR位點(diǎn)的抗性標(biāo)記得到有效刪除。重組酶FLP在Gluconobacter suboxydans的表達(dá)提供了一種循環(huán)使用選擇標(biāo)記基因進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)基因敲除或置換的方法。

弱氧化葡糖桿菌；FLP/FRT；位點(diǎn)特異性重組；啟動子；基因敲除

重組酶近年來成為非常普及的現(xiàn)代分子生物學(xué)理論研究與基因工程技術(shù)開發(fā)的重要工具，最常用的重組酶包括細(xì)菌來源的Cre和酵母來源的FLP[1]。FLP重組酶（flippase recombination enzyme）又稱轉(zhuǎn)位蛋白，其基因來源于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2μ質(zhì)粒，編碼422個(gè)氨基酸，是一個(gè)大小約48kD的多肽單體蛋白。該蛋白作用于34bp的FRT位點(diǎn)（flippaserecognition targets）[2]，根據(jù)FRT識別位點(diǎn)的位置與方向，F(xiàn)LP重組酶以特定方式結(jié)合到FRT兩端的對稱序列上，誘使FRT位點(diǎn)產(chǎn)生彎曲、斷裂，從而引發(fā)完成FRT位點(diǎn)間基因的刪除、倒置、交換等修飾，實(shí)現(xiàn)DNA序列的刪除、倒位、插入和重排等反應(yīng)，因此被廣泛應(yīng)用于微生物、植物及動物的基因組的修飾[2-9]。弱氧化葡糖桿菌（Gluconobacter suboxydans）具有豐富的周知空間氧化還原酶類，如葡萄糖脫氫酶[10]、山梨醇脫氫酶[11]，甘油脫氫酶[12]等，可催化葡萄糖、山梨醇、甘油等生成葡萄糖酸、山梨糖和二氫丙酮等化工產(chǎn)品，是一類重要的工業(yè)菌[13-16]，對其進(jìn)行菌種改造，獲得可產(chǎn)業(yè)化顯示的遺傳資源具有重要意義。但是由于其遺傳背景知識相對缺乏、有多樣的內(nèi)源性質(zhì)粒和廣泛的抗性譜等因素，給遺傳實(shí)驗(yàn)操作帶來很大的難度。在Gluconobacter suboxydans遺傳操作體系以及對其基因組DNA進(jìn)行修飾改造的技術(shù)手段等方面的研究，國內(nèi)外還基本處于空白。本實(shí)驗(yàn)借助寬宿主載體pBBR1MCS-5，先獲得插入終止子的重組質(zhì)粒pBBR1MCS-5-ter，在此基礎(chǔ)上，再構(gòu)建不同來源啟動子調(diào)控的f p的表達(dá)載體。

通過重組酶FLP在Gluconobacter suboxydans中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同時(shí)引發(fā)FRT-FLP位點(diǎn)特異性重組，可以有效地去除葡萄糖脫氫酶缺失突變菌株的四環(huán)素抗性標(biāo)記，提供了一種循環(huán)使用選擇標(biāo)記基因進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)基因敲除或置換的方法[9,17-21]，為快速、高效、方便、穩(wěn)定地進(jìn)行基因的修飾改造提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Trizol 美國Invitrogen公司；焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC） 生工生物工程（上海）股份有限公司；EasyScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、FastPfu DNA聚合酶、Hifi DNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

培養(yǎng)基：2 g/100 mL葡萄糖、1.0 g/100 mL玉米漿、0.1 g/100 mL KH2PO4、0.4 g/100 mL硫酸銨、0.02 g/100 mL硫酸鎂、0.01 g/100 mL碳酸鈣，pH值調(diào)制6.4～6.7，121 ℃滅菌20 min；如需固體培養(yǎng)基，加入2.0%的瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

實(shí)驗(yàn)所用菌株，質(zhì)粒以及相關(guān)引物的詳細(xì)信息如表1所示。

1.2 儀器與設(shè)備

Bio-Rad My CyclerTM梯度PCR儀、Bio-Rad Gel DOCXR System凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；Gene Pulser XcellTM電轉(zhuǎn)儀 美國Bio-Rad公司；Neofuge23R冷凍離心機(jī) 河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一廠；HWS型培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；DZKW-D水浴鍋 河北黃驊航天儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒pBBR1MCS-5-ter寬宿主載體的構(gòu)建

以G. suboxydans基因組DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增出具有終止子作用的ter基因片段，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃、5 min；95 ℃、30 s，退火（Tm值不同）30s，72 ℃、25 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將目的基因ter和載體pBBR1MCS-5進(jìn)行Hind Ⅲ和SalⅠ雙酶切，電泳驗(yàn)證后回收，T4連接酶反應(yīng)過夜，熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，挑取單菌落，將轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證正確后保菌備用，并由Invitrogen公司測序。

1.3.2 f p基因片段與3種啟動子融合的overlapping PCR

以pEASY-flp、pEASY-sldh、pBBR1MCS-5為模板，tufB利用長引物融合，均用PCR分別擴(kuò)增出flp、psldh、ptufB和慶大（pgen）基因片段，得到的片段作為下一次PCR的反應(yīng)模板，PCR反應(yīng)程序參考1.3.1節(jié)。再利用重疊延伸PCR技術(shù)，選用正確引物，調(diào)整兩個(gè)模版的物質(zhì)的量比，分別將sldh、tufB、gen基因啟動子片段分別作為模版1，flp基因作為模版2，二者進(jìn)行搭接，克隆出帶有3種啟動子的f p基因片段，PCR反應(yīng)程序參考1.3.1節(jié)。

1.3.3 f p基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將目的基因和測序正確的載體pBBR1MCS-5-ter進(jìn)行BamHⅠ和Pst Ⅰ雙酶切，37 ℃反應(yīng)過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳驗(yàn)證正確后使用超薄產(chǎn)物純化試劑盒回收后，將酶切后的融合了啟動子的flp基因分別與載體用T4連接酶16 ℃過夜連接，后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，挑取單菌落，將轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證正確后保菌備用，并由Invitrogen公司測序。

表1 本實(shí)驗(yàn)中采用的菌株、質(zhì)粒和寡核苷酸Table1 Strains, plasmids, and oligonucleotides used in this study

1.3.4 弱氧化葡糖桿菌的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

將構(gòu)建成功并測序正確的載體pBBR1MCS-psldh-flp、pBBR1MCS-ptufB-flp、pBBR1MCS-pgen-flp利用電穿孔轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)入到受體細(xì)胞弱氧化醋酸桿菌中，具體方法：將10 μL打靶片段和50 μL感受態(tài)細(xì)胞輕輕混合，冰浴5 min，轉(zhuǎn)入事先冷卻的電擊杯；設(shè)置不同的電壓分別為1.25、1.5、1.8 kV/cm，固定電阻為250 Ω，電容為25 μF，電擊；電擊完后立刻向電擊杯中加入1 mL事先冷卻的種子培養(yǎng)基，沖洗轉(zhuǎn)移至離心管中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)5 h，收集細(xì)胞，涂于平板中。優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，待48～72 h后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子，按照菌落PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5 RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）驗(yàn)證目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

將3種載體轉(zhuǎn)入弱氧化葡糖桿菌的轉(zhuǎn)化子擴(kuò)培24～48 h后，采取Trizol試劑一步法提取總RNA，具體操作參照Trizol試劑說明書。

利用北京全式金公司的EasyScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒，兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。首先合成cDNA，按照說明書體系，輕輕混勻試劑，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育30 min，然后85 ℃加熱5 min，使EasyScript RT失活。取2～4 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA作為PCR模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)過程參考1.3.1節(jié)。

1.3.6 去除JGDH－菌株的抗性基因

JGDH－菌是野生型中編碼GDH的基因gdh被兩端帶有FRT識別位點(diǎn)的四環(huán)素表達(dá)盒所替代的突變菌株。參見1.3.4節(jié)的轉(zhuǎn)化方法，將pBBR1MCS-psldh-flp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞JGDH－菌中，孵育培養(yǎng)10h，涂布于固體培養(yǎng)基上，待出現(xiàn)菌落后，挑取菌落分別培養(yǎng)在含有四環(huán)素及不含四環(huán)素的培養(yǎng)基的微孔板中，測定菌液OD600nm值，根據(jù)生長情況篩選除去抗性的菌株。再通過菌落PCR進(jìn)行驗(yàn)證四環(huán)抗性的去除。

2 結(jié)果與分析

2.1 終止子ter基因擴(kuò)增

圖1 1 terter基因PCR產(chǎn)物PCRFig.1 PCR amplified products of ter gene

實(shí)驗(yàn)以G. suboxydans基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得有終止子作用的ter基因片段，如圖1所示，目的條帶大小與已知序列相同，說明終止基因ter擴(kuò)增成功。

2.2 重組質(zhì)粒pBBR1MCS-5-ter的構(gòu)建

將目的基因ter和載體pBBR1MCS-5進(jìn)行Hind Ⅲ和Sal Ⅰ雙酶切，電泳驗(yàn)證后回收，經(jīng)過酶切連接轉(zhuǎn)化，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示，條帶位置與上述PCR擴(kuò)增片段大小一致，說明目的基因ter已插入載體pBBR1MCS-5中，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，比對測序結(jié)果正確，說明構(gòu)建成功。

圖2 質(zhì)粒PC Rtteerr基因的插入Fig.2 PCR validation of insertion of the ter gene

2.3 重疊延伸PCR融合啟動子與f p基因

圖3 3種啟動子基因與f pf p基因PCR產(chǎn)物PCRFig.3 PCR amplified products of three promoter genes and f p gene

實(shí)驗(yàn)采用重疊延伸PCR技術(shù)，選擇相應(yīng)的引物和模版，tufB利用長引物融合，另外分別擴(kuò)增出flp、psldh、ptufB和pgen基因片段，如圖3所示。其中，啟動子psldh基因片段大小為191 bp，啟動子pgen基因大小為276 bp，不同引物擴(kuò)增的flp基因大小為1 300 bp左右，與已知序列大小相同。

以上一步PCR擴(kuò)增的結(jié)果為模版，等量混勻后，利用Hifi DNA聚合酶分別用各自引物進(jìn)行PCR搭接，獲得各自的目的片段，如圖4所示。

圖4 3種啟動子與ff pp基因PCR搭接結(jié)果Fig.4 PCR overlap products from three promoter genes and f p gene

2.4 融合啟動子基因psldh、ptufB、pgen的flp基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將搭接成功的3種基因片段利用超薄瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與空質(zhì)粒pBBR1MCS-5-ter經(jīng)過酶切連接轉(zhuǎn)化，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，提質(zhì)粒后分別利用引物SLDHF/FLPR、TUFBF/FLPR、GENF/FLPR驗(yàn)證構(gòu)建好的載體pBBR1MCS-psldh-flp、pBBR1MCS-ptufB-flp、pBBR1MCS-pgen-flp，驗(yàn)證結(jié)果如圖5所示，條帶位置與設(shè)計(jì)一致，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，比對測序結(jié)果正確，說明構(gòu)建成功。

圖5 3種質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證Fig.5 PCR validation of three plasmids

2.5 flp基因在弱氧化葡糖桿菌中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及RT-PCR驗(yàn)證

分別將成功構(gòu)建的質(zhì)粒pBBR1MCS-psldh-flp、pBBR1MCS-ptufB-f p、pBBR1MCS-pgen-f p利用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到目的菌株弱氧化葡糖桿菌中，經(jīng)過48～72h后長出單菌落。菌落PCR驗(yàn)證篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。為驗(yàn)證3種啟動子控制的flp基因在宿主中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，利用Trizol法提取含有3種弱氧化醋酸桿菌陽性克隆的RNA，利用電泳驗(yàn)證所提RNA的完整性，28S和18S條帶清晰可見，進(jìn)行RT-PCR結(jié)果如圖6所示，PCR所得片段分別與陽性對照位置相同，并且弱氧化葡糖桿菌本身RNA并沒有擴(kuò)增相應(yīng)條帶，說明sldh、tufB、gen啟動子都可被弱氧化葡糖桿菌識別，有效啟動f p基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖6 含3種質(zhì)粒的弱氧化葡糖桿菌RT-PCR驗(yàn)證Fig.6 RT-PCR validation of Gluconobacter suboxydans with three plasmids

2.6 利用flp在弱氧化葡糖桿菌的表達(dá)去除JGDH－菌株的抗性基因

將pBBR1MCS-psldh-flp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞JGDH－菌中。由于四環(huán)素抗性基因兩端的FRT位點(diǎn)同向，F(xiàn)LP在JGDH-菌中表達(dá)后，將FRT位點(diǎn)間的四環(huán)素抗性基因刪除，F(xiàn)LP/FRT刪除JGDH-菌株的四環(huán)抗性基因的作用機(jī)理，如圖7所示。

圖7 FLP/FRT的作用機(jī)理Fig.7 The action mechanism of FLP/FRT

挑取轉(zhuǎn)化子單菌落擴(kuò)培，將其分別接入無抗培養(yǎng)基和含四環(huán)抗性的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時(shí)間后，測定菌液OD值，該菌在無四環(huán)抗性培養(yǎng)基中生長，在四環(huán)抗性培養(yǎng)基中不生長。挑取上述已初步驗(yàn)證的無抗性基因的單菌落，利用引物TETYF/TETYR進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖8所示，只有沒有轉(zhuǎn)化pBB1MCS-psldh-flp的JGDH－菌株有1 100 bp左右的條帶（四環(huán)抗性基因），進(jìn)一步說明pBB1MCS-psldh-flp轉(zhuǎn)入JGDH－菌株后，F(xiàn)LP有效表達(dá)，在FLP/FRT重組系統(tǒng)作用下四環(huán)抗性標(biāo)記被刪除。并通過多次在無抗性的培養(yǎng)基上傳代，去除pBBR1MCS-psldh-flp質(zhì)粒，得到穩(wěn)定的無任何抗性標(biāo)記的JGDH－菌株。

圖8 抗性標(biāo)記去除的PCR驗(yàn)證Fig.8 PCR validation of the removal of resistance markers

3 討 論

寬宿主載體pBBR1MCS-5可在多種宿主中克隆表達(dá)，具有其特有的優(yōu)越性；而目前Gluconobacter suboxydans適用基因操作的工具有限，肖蘇珂等[22]發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒在Gluconobacter suboxydans中能夠很好地克隆表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)利用該質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)為其插入具有終止作用的ter基因，構(gòu)建了適用于Gluconobacter suboxydans的表達(dá)載體pBBR1MCS-5-ter。

通過重疊延伸PCR技術(shù)分別獲得含有sldh、tufB、gen基因啟動子片段的flp基因，與改造的寬宿主載體pBBR1MCS-5-ter連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒，再電轉(zhuǎn)化至弱氧化葡糖桿菌中。有研究發(fā)現(xiàn)[18]，經(jīng)分離得到多個(gè)具有啟動子功能的DNA片段上具有典型的細(xì)菌啟動子保守序列（－35和－10區(qū)），被命名為Lhp啟動子，該啟動子可被Gluconobacter suboxydans識別；本實(shí)驗(yàn)受控于sldh、tufB、gen啟動子的重組質(zhì)?？杀籊luconobacter suboxydans識別，并都能有效啟動flp基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，拓展了Gluconobacter suboxydans遺傳操作系統(tǒng)的調(diào)控原件。

FLP是來自釀酒酵母2μ質(zhì)粒編碼的特異性重組酶，蓋穎[23]、劉香利[24]、單曉昳[9]等已發(fā)現(xiàn)FLP重組酶通過FLP/FRT重組系統(tǒng)在原核大腸桿菌及植物中能有效識別并刪除重組位點(diǎn)FRT之間的基因。本實(shí)驗(yàn)借助構(gòu)建的Gluconobacter suboxydans的表達(dá)載體，通過FLP重組酶在Gluconobacter suboxydans中轉(zhuǎn)錄表達(dá)，可以將葡萄糖脫氫酶缺失突變菌株的四環(huán)素抗性標(biāo)記去除，這樣既能夠改善該系統(tǒng)去除選擇標(biāo)記的效率和穩(wěn)定性，同時(shí)能夠循環(huán)使用選擇標(biāo)記基因進(jìn)行敲除或置換多個(gè)位點(diǎn)基因，為快速、高效、方便、穩(wěn)定地進(jìn)行Gluconobacter suboxydans基因的修飾提供了有效工具，同時(shí)為Gluconobacter suboxydans基因改造方面的進(jìn)一步研究提供參考，這方面的研究還未見報(bào)道。

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Expression and Application of Recombinase FLP in Gluconobacter suboxydans

LIU Jing-wen, LI Tian-ming, DU Hong-yan, FENG Hui-yong*
(College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050000, China)

In this paper, the broad-host vector pBB1MCS-5 was used to construct an expression vector for flippase recombination enzyme (FLP). The expression vector was transformed into Gluconobacter suboxydans, and the positive transformants were screened. The results of validation using a two-step RT-PCR method showed that f p was transcribed and expressed in the host cell. The pBBR1MCS-psldh-f p recombinant plasmid was transformed into tetracyclic-resistant JGDH－mutant strains, and PCR verification showed that the sites with FTR resistance marker had been effectively removed. Recombination FLP expression in Gluconobacter suboxydans provides a method that circularly uses the selectable marker gene to knock out or replace multiple locus genes.

Gluconobacter suboxydans; FLP/FRT; site-specif c recombination; promoter; gene knock-out

Q789

A

1002-6630（2014）11-0204-05

10.7506/spkx1002-6630-201411041

2013-07-17

劉靜文（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榇x工程。E-mail：liujingwen_1988@126.com

*通信作者：馮惠勇（1967—），女，教授，碩士，研究方向?yàn)榇x工程與酶的定向進(jìn)化。E-mail：fenghuiyong@163.com